SKŁADAJĄCY PETYCJĘ:                     1 grudnia 2020 roku

dr nauk med. Wolfgang Wodarg   

Niemcy

WSPÓŁSKŁADAJĄCY PETYCJĘ:

dr Michael Yeadon

Anglia, CT3 1RT

ODBIORCA:

Europejska Agencja Leków

Komitet ds. Produktów Leczniczych Stosowanych u Ludzi (CHMP)

Grupa zadaniowa ds. pandemii COVID-19 Europejskiej Agencji Leków (COVID-ETF)

Domenico Scarlattilaan 6

1083 HS Amsterdam

Królestwo Niderlandów

info@ema.europa.eu

press@ema.europa.eu   

!! PILNE !!

PETYCJA/WNIOSEK O PODJĘCIE DZIAŁAŃ ADMINISTRACYJNYCH/REGULACYJNYCH DOTYCZĄCYCH POTWIERDZENIA PARAMETRÓW KOŃCOWYCH DOTYCZĄCYCH SKUTECZNOŚCI I WYKORZYSTANIA DANYCH W ZWIĄZKU Z NASTĘPUJĄCYM(-I) BADANIEM(-AMI) KLINICZNYMI:

FAZA III ? NUMER EUDRACT: 2020-002641-42

NUMER PROTOKOŁU SPONSORA: C4591001

SPONSOR:

BIONTECH SE (SOCIETAS EUROPAEA), AN DER GOLDGRUBE 12, 55131 MOGUNCJA, NIEMCY

ORAZ WSZELKICH INNYCH TRWAJĄCYCH BADAŃ KLINICZNYCH KANDYDATÓW NA SZCZEPIONKĘ ZAPROJEKTOWANYCH W CELU POWSTRZYMANIA PRZENOSZENIA WIRUSA Z OSOBY ZASZCZEPIONEJ NA INNE OSOBY ORAZ W CELU ZAPOBIEŻENIA COVID-19 LUB ZŁAGODZENIA OBJAWÓW COVID-19, DLA KTÓRYCH WYNIKI PCR STANOWIĄ PODSTAWOWY DOWÓD NA ISTNIENIE ZAKAŻENIA WIRUSEM SARS-COV-2

ADMINISTRACYJNE/REGULACYJNE WSTRZYMANIE DZIAŁAŃ

Niniejszą petycję o wstrzymanie działań składa niżej podpisany (?Składający petycję? lub ?Główny składający petycję?), wnosząc do EMA o a) wstrzymanie badania klinicznego/badań klinicznych III fazy BNT162b (EudraCT Numer 2020-002641-42) w UE (kraj obecnie objęty protokołem: Niemcy) do czasu opracowania projektu badania, który zostanie zmieniony w taki sposób, aby były one zgodne z żądaniami w sekcji ?Wymagane działania? (B.) poniżej; oraz b) wstrzymanie wszystkich innych badań klinicznych kandydatów na szczepionkę, mające na celu powstrzymanie przenoszenia wirusa z osoby zaszczepionej na inne i/lub zapobieżenie lub złagodzenie objawów COVID-19, dla których wyniki PCR są podstawowym dowodem na obecność zakażenia.

Ze względu na pilną potrzebę zapewnienia bezpieczeństwa i skuteczności każdej szczepionki na COVID-19 dopuszczonej przez EMA (i/lub niemiecki Instytut Paula-Ehrlicha) oraz umożliwienia składającemu petycję uzyskania odpowiedniej pomocy sądowej w nagłych przypadkach, gdyby EMA odmówiło przyjęcia petycji, składający petycję z szacunkiem zwraca się do EMA o niezwłoczne podjęcie działań w związku z niniejszą petycją.

A. POWIĄZANE DECYZJE

I. Zatwierdzenie planu badania klinicznego i/lub decyzja o niekwestionowaniu planu badania klinicznego dla fazy III badania BNT162 (numer EudraCT 2020-002641-42).

II. Zatwierdzenie planu badania klinicznego i/lub decyzja o niezakwestionowaniu planów badania klinicznego wszystkich zagranicznych badań klinicznych kandydatów na szczepionkę, mających na celu powstrzymanie przenoszenia wirusa z osoby zaszczepionej na inne osoby i/lub zapobieżenie lub złagodzenie objawów COVID-19, dla których wyniki PCR są podstawowym dowodem na obecność zakażenia.

B. WNIOSKOWANE DZIAŁANIE

I. Wstrzymanie III fazy badania BNT162 w kraju objętym protokołem, czyli w Niemczech, oraz we wszystkich innych krajach objętych protokołem UE (w zależności od przypadku), do czasu zmiany planu badania, tak aby zagwarantować, że:

Przed wydaniem nadzwyczajnego dopuszczenia/warunkowego zatwierdzenia i/lub nieograniczonego dopuszczenia szczepionki firm Pfizer/BioNTech, wszystkie ?parametry końcowe? lub przypadki COVID-19 użyte do określenia skuteczności szczepionki w badaniach fazy 3 lub 2/3 powinny mieć status zakażenia potwierdzony przez odpowiednie sekwencjonowanie DNA metodą Sangera (jak opisano w sekcji C. III. poniżej), biorąc pod uwagę a) wysokie wartości progowe cyklu stosowane w niektórych badaniach; oraz b) wady konstrukcyjne niektórych badań RT-qPCR identycznych lub modelowanych na tak zwanym ?teście Drostena?.

II. Wstrzymanie badań klinicznych wszystkich kandydatów na szczepionkę, których celem jest powstrzymanie przenoszenia wirusa z osoby zaszczepionej na inne osoby i/lub zapobieżenie lub złagodzenie objawów COVID-19, dla których wyniki PCR są podstawowym dowodem na obecność zakażenia, do czasu zmiany projektu badania, tak aby zapewnić, że:

Przed wydaniem nadzwyczajnego dopuszczenia/warunkowego zatwierdzenia i/lub nieograniczonego dopuszczenia szczepionki przeznaczonej do powstrzymania przenoszenia wirusa z osoby zaszczepionej na inne osoby i/lub w celu zapobieżenia lub łagodzenia objawów COVID-19, wszystkie ?parametry końcowe? lub przypadki COVID-19 wykorzystane do określenia skuteczności szczepionki powinny uzyskać status zakażenia potwierdzony przez odpowiednie sekwencjonowanie DNA metodą Sangera (jak opisano w sekcji B. III. poniżej), biorąc pod uwagę a) wysokie wartości progowe cyklu stosowane w niektórych badaniach; oraz b) wady konstrukcyjne niektórych badań RT-qPCR identycznych lub modelowanych na czymś, co czasami nazywane jest ?testem Drostena?.

III. Wysokie wartości progowe cyklu, czyli wartości Ct w badaniach RT-qPCR, zostały szeroko uznane za prowadzące do wyników fałszywie dodatnich. Ponadto, grupa naukowców i badaczy niedawno wezwała do wycofania artykułu opisującego tzw. ?test Drostena? (czasami określany również jako ?protokół Cormana i Drostena? ? swoisty test RT-qPCR opisany przez Victora M. Cormana, Christiana Drostena i innych: ?Wykrywanie nowego koronawirusa z 2019 roku (2019-nCoV) za pomocą testów RT-PCR w czasie rzeczywistym? Euro Surveillance 2020;25(3):pii=2000045. https://doi.org/10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045). 

Wszystkie dodatnie wyniki testów RT-qPCR stosowane do klasyfikowania pacjentów jako ?przypadków COVID-19? w badaniach i stosowane do kwalifikacji parametrów końcowych badania powinny być weryfikowane przez sekwencjonowanie DNA metodą Sangera w celu potwierdzenia, że badane próbki rzeczywiście zawierają unikatowe genomowe RNA SARS-CoV-2. Zgodnie z wymaganiami FDA i EMA dla potwierdzonej diagnozy wirusa brodawczaka ludzkiego (HPV) przy użyciu PCR, sekwencjonujący elektrofenogram musi wykazywać minimum 100 sąsiadujących ze sobą baz odpowiadających sekwencji referencyjnej o wartości oczekiwanej (E Value) <10-30 dla swoistej sekwencji genu SARS-CoV-2 w oparciu o przeszukiwanie bazy danych GenBank (zwana również ?bazą danych nukleotydów NCBI?).

C. UZASADNIENIE

I. Jak szczegółowo opisano w niniejszym dokumencie (i) bez wnioskowanego wstrzymania składający petycję oraz wielu mieszkańców/obywateli UE poniesie nieodwracalne szkody, (ii) wniosek nie jest błahy i jest składany w dobrej wierze, (iii) wniosek jest wyrazem dbałości o należyty porządek publiczny oraz (iv) zgoda na wstrzymanie sprzyja interesowi publicznemu.

II. Składający petycję uważa, że obecne plany badań klinicznych dla fazy II/III badań BNT162b (?badanie firm Pfizer/BioNTech?) są niewystarczające, by precyzyjnie ocenić skuteczność. Składający petycję uważa również, że plany badań klinicznych kandydatów na szczepionki mające na celu powstrzymanie przenoszenia wirusa z osoby zaszczepionej na inne osoby i/lub zapobieżenie objawom COVID-19 lub złagodzenie ich skutków, dla których wyniki PCR są podstawowym dowodem na obecność zakażenia, są nieadekwatne do dokładnej oceny skuteczności.

III. Składający petycję i społeczeństwo poniosą nieodwracalne szkody, jeśli nie zostaną podjęte działania, o których mowa w niniejszym dokumencie, ponieważ po zatwierdzeniu przez EMA (i inne właściwe organy w różnych państwach członkowskich UE) omawianych szczepionek na COVID-19, zarówno rządy państw członkowskich UE, jak i pracodawcy w UE najprawdopodobniej zalecą je do powszechnego stosowania. Jeżeli w trakcie badań przypadki są stwierdzane i rozpoznawane jako COVID lub nie w sposób niedokładny, wówczas szczepionki nie zostaną odpowiednio przetestowane. Jeżeli szczepionki nie zostaną odpowiednio przetestowane, ważne decyzje polityczne w sferze publicznej dotyczące ich stosowania, będą oparte na dowodach wprowadzających w błąd. Trudno o bardziej poważne konsekwencje medyczne i ekonomiczne dla państw członkowskich UE i ich mieszkańców/obywateli.

IV. Ponadto, jeżeli szczepionki zostaną zatwierdzone bez odpowiedniego i dokładnego przeglądu ich skuteczności, wówczas wszelkie ewentualne zatwierdzenie lub zlecenie stosowania tych szczepionek prawdopodobnie będzie opierać się na niedokładnych dowodach dotyczących szczepionki, a mianowicie, że zatrzyma ona przenoszenie wirusa z osoby zaszczepionej na inne osoby lub że ograniczy zachorowalność na COVID-19 i umieralność. Protokół badań klinicznych firm Pfizer/BioNTech i inne protokoły badań klinicznych nie mają obecnie na celu ustalenia, czy którykolwiek z tych celów może zostać osiągnięty; a nawet gdyby miały, jeśli nie można zidentyfikować przypadków w wiarygodny sposób, żaden z tych celów nie może zostać wiarygodnie osiągnięty.

V. Interes publiczny również zdecydowanie przemawia za wnioskowanym wstrzymaniem, ponieważ poprawa w zakresie dokładnego określenia podstawowych parametrów końcowych (i) będzie zgodna z najlepszymi praktykami naukowymi, (ii) zwiększy zaufanie społeczne do skuteczności produktu, który może być zlecany lub przeznaczony do powszechnego stosowania, oraz (iii) nieudzielenie zgody na wnioskowane wstrzymanie będzie miało odwrotny skutek i spowoduje niepewność co do skuteczności i zapotrzebowania na szczepionki przeciwko COVID-19.

VI. Składający petycję niniejszym powołuje się na podstawy, fakty, argumenty i opinie zawarte w ?PETYCJI O PODJĘCIE DZIAŁAŃ ADMINISTRACYJNYCH DOTYCZĄCYCH ZATWIERDZENIA PARAMETRÓW KOŃCOWYCH SKUTECZNOŚCI FAZY III BADAŃ KLINICZNYCH SZCZEPIONEK NA COVID-19?, która została złożona do FDA (Amerykańska Agencja Żywności i Leków) przez dr. Sin Hang Lee w formie elektronicznej w dniu 25 listopada 2020 roku (Załącznik A ? nr dok. FDA-2020-P-2225). Załączony do niniejszej petycji Załącznik A powinien być włączony do niniejszej petycji i rozumiany jako część niniejszej petycji, tak jakby stanowił on jej treść.

VII. Składający petycję uwzględnia również podstawy, fakty, argumenty i opinie przedstawione w zewnętrznej ocenie ?testu Drostena? w ramach wzajemnej weryfikacji (załącznik B). Wady konstrukcyjne niektórych testów RT-qPCR, które są identyczne lub modelowane na tzw. ?teście Drostena?, mogą prowadzić do uzyskania wyników fałszywie dodatnich w badaniach zaprojektowanych tak, że wyniki PCR są podstawowym dowodem na obecność zakażenia. Załącznik B powinien być włączony do niniejszej petycji i rozumiany jako część niniejszej petycji, tak jakby stanowił on jej treść.

VIII. Aby szczepionka zadziałała, nasz system odpornościowy musi zostać pobudzony do wyprodukowania neutralizujących przeciwciał, które są przeciwieństwem do przeciwciał nieneutralizujących. Przeciwciało neutralizujące to takie, które może rozpoznać i związać się z pewnym regionem (?epitopem?) wirusa, a następnie powoduje, że wirus albo nie przedostaje się do komórek, albo się nie replikuje. Nieneutralizujące przeciwciało to takie, które może wiązać się z wirusem, ale z jakiegoś powodu nie neutralizuje jego zakaźności. W niektórych wirusach, jeśli osoba jest nosicielem nieneutralizującego przeciwciała przeciwko wirusowi, kolejne zakażenie wirusem może spowodować, że u osoby tej wywołana zostanie poważniejsza reakcja na wirusa ze względu na obecność nieneutralizującego przeciwciała. Nie dotyczy to wszystkich wirusów, a jedynie tych szczególnych. Nazwa tego zjawiska to Antibody Dependent Enhancement (ADE) [wzmocnienie zależne od przeciwciała] i jest powszechnym problemem w przypadku takich wirusów jak denge, Ebola, HIV, RSV i rodzina koronawirusów. W rzeczywistości problem ADE jest głównym powodem, dla którego wiele wcześniejszych prób opracowania szczepionki na inne koronawirusy się nie powiodło. Poważne zastrzeżenia co do bezpieczeństwa zaobserwowano w modelach zwierzęcych. Jeśli ADE występuje u osobnika, jego reakcja na wirusa może być bardziej niekorzystna niż w przypadku, gdyby nigdy nie wytworzył w ogóle przeciwciał. Może to spowodować reakcję hiperzapalną, burzę cytokinową i ogólne rozregulowanie układu odpornościowego, które pozwolą wirusowi na spowodowanie większych uszkodzeń płuc i innych organów naszego organizmu. Ponadto, nowe typy komórek w naszym organizmie są teraz podatne na infekcje wirusowe ze względu na dodatkową drogę przedostawania się wirusa. Istnieje wiele badań, które pokazują, że w ogóle ADE jest stałym problemem, jeśli chodzi o koronawirusy, a w szczególności wirusy związane z SARS. ADE okazało się być poważnym wyzwaniem w przypadku szczepionek na koronawirusa i jest główną przyczyną niepowodzenia wielu takich szczepionek we wczesnych badaniach in vitro lub na zwierzętach. Na przykład makaki królewskie, które zostały zaszczepione białkiem kolczastym wirusa SARS-CoV, wykazywały poważne ostre uszkodzenie płuc, kiedy ich organizm musiał odpowiedzieć na SARS-CoV, podczas gdy małpy, które nie były szczepione, nie wykazywały takiego uszkodzenia. Podobnie u myszy zaszczepionych jedną z czterech różnych szczepionek SARS-CoV wykazano zmiany histopatologiczne w płucach z naciekiem eozynofilowym po zakażeniu wirusem SARS-CoV.

IX. Istnieją pewne niepokojące kwestie związane z planami badań klinicznych opisanymi przez dr. Petera Doshiego w British Medical Journal. Dr Doshi skupia się na dwóch najpoważniejszych kwestiach. Po pierwsze, żaden z wiodących planów badań kandydatów na szczepionki nie jest zaprojektowany tak, by sprawdzić, czy szczepionka może zmniejszyć objawy ciężkiej postaci COVID-19, definiowane jako: hospitalizacja, przyjęcie na oddział intensywnej opieki medycznej lub zgon. I, po drugie, badania nie są zaprojektowane tak, by sprawdzić, czy szczepionka może przerwać transmisję wirusa (https://www.bmj.com/content/bmj/371/bmj.m4037.full.pdf). Jeżeli żaden z tych warunków nie jest spełniony, szczepionka w istocie działa jak lek, za wyjątkiem szczepionki, która byłaby przyjmowana profilaktycznie, nawet przez całkowicie zdrowego człowieka. Jest bardziej niż prawdopodobne, że niesie to ze sobą większe ryzyko spowodowania szkody niż lek terapeutyczny. Gdyby to było prawdą, to leki miałyby przewagę nad każdą szczepionką COVID.

X. W kandydacie na szczepionkę firm Pfizer/BioNTech mRNA, glikol polietylenowy (PEG) znajduje się w powłoce nanocząsteczek lipidowych tłuszczu wokół mRNA. Siedemdziesiąt procent osób wytwarza przeciwciała przeciwko glikolowi polietylenowemu PEG i większość nie zdaje sobie z tego sprawy, co stwarza niepokojącą sytuację, w której wiele z tych osób mogłoby mieć alergiczną, potencjalnie śmiertelną, reakcję na szczepionkę zawierającą PEG. Przeciwciała PEG mogą również zmniejszać skuteczność szczepionki. Firmy Pfizer/BioNTech wprowadzają również do swojej szczepionki pochodzący od bezkręgowca morskiego składnik zwany mNeonGreen. Składnik ten ma właściwości bioluminescencyjne, co czyni go atrakcyjnym dla celów obrazowania medycznego, ale nie jest jasne, dlaczego wstrzykiwana szczepionka musiałaby mieć taką cechę. Antygenowość mNeonGreen jest nieznana.

XI. Oczekuje się, że kilku kandydatów na szczepionki będą indukować powstawanie przeciwciał humoralnych przeciwko białkom kolcowym SARS-CoV-2. Syncytyna-1 (patrz Gallaher, B., ?Response to nCoV2019 Against Backdrop of Endogenous Retroviruses? [PL: Odpowiedź na nCoV2019 w kontekście endogenicznych retrowirusów] ? http://virological.org/t/response-to-ncov2019-against-backdrop-of-endogenous-retroviruses/396), która pochodzi od ludzkich endogennych retrowirusów (HERV) i jest odpowiedzialna za rozwój łożyska u ssaków i ludzi ? i dlatego jest niezbędnym warunkiem udanej ciąży ? znajduje się również w formie homologicznej w białkach kolczastych wirusów SARS. Nic nie wskazuje na to, aby przeciwciała przeciwko białkom kolczastym wirusów SARS działały również jak przeciwciała przeciwko Syncytynie-1. Gdyby jednak tak się działo, zapobiegłoby to również powstawaniu łożyska, które powodowałoby, że zaszczepione kobiety stałyby się zasadniczo niepłodne. Według mojej wiedzy firmy Pfizer/BioNTech nie udostępniły jeszcze żadnych próbek materiałów pisemnych dostarczonych pacjentom, więc nie jest jasne, jakie informacje są w nich zawarte na temat (potencjalnego) związanego z płodnością ryzyka dla danego rodzaju przeciwciał.

Zgodnie z punktem 10.4.2 protokołu badania firm Pfizer/BioNTech, kobieta w wieku rozrodczym (WOCBP) może wziąć udział w badaniu, jeśli nie jest w ciąży lub karmiąca piersią i stosuje akceptowalną metodę antykoncepcyjną opisaną w protokole badania w okresie interwencji (przez co najmniej 28 dni od ostatniej dawki w ramach interwencji).

Oznacza to, że może upłynąć względnie dużo czasu, zanim da się zaobserwować zauważalną liczba przypadków niepłodności poszczepiennej.

XII. Zdaje się, że firmy Pfizer/BioNTech nie udostępniły jeszcze próbek pisemnych materiałów dostarczonych pacjentom, więc nie jest jasne, jakie, o ile w ogóle, instrukcje/informacje dotyczące kwestii związanych z ADE i PEG oraz (potencjalnych) kwestii związanych z płodnością lub ciążą zostały przekazane pacjentom/osobom biorącym udział w badaniu.

D. WSTRZYMANIE JEST PILNIE WYMAGANE

I. Składający petycję i wielu mieszkanieców/obywateli UE poniesie nieodwracalną szkodę, ponieważ po zatwierdzeniu przez EMA przedmiotowej szczepionki COVID 19 zarówno rządy państw członkowskich UE, jak i pracodawcy w UE najprawdopodobniej zalecą ją do powszechnego stosowania, a zatem jeśli EMA nie zapewnieni odpowiednich testów bezpieczeństwa szczepionek w teraz, składający petycję i inni nie będą mieli możliwości zgłoszenia sprzeciwu wobec otrzymania szczepionki opracowanej na podstawie niewystarczających badań klinicznych w późniejszym terminie.

II. Ponadto, jeżeli szczepionki zostaną dopuszczone bez odpowiedniego przeglądu skuteczności i bez poprawy dokładnego określenia podstawowych parametrów końcowych, wówczas wszelkie ewentualne zatwierdzenia lub zalecenia stosowania tych szczepionek prawdopodobnie będą oparte na niedokładnych przekonaniach i danych dotyczących szczepionek, a mianowicie, że zatrzymają one lub mogą zatrzymać przenoszenie wirusa z osoby zaszczepionej na inne osoby i/lub że ograniczą one ilość zachorowań na COVID-19 o ostrym przebiegu i związanych z nim zgonów. Protokoły badań klinicznych, o których mowa, nie są obecnie opracowane prawidłowo do tego, by określić, czy którykolwiek z tych celów może zostać osiągnięty.

III. Niniejsza petycja nie jest również kwestią błahą i jest składana w dobrej wierze, ponieważ ma ona na celu zwiększenie rzetelności naukowej i wiarygodności badań szczepionek przeciwko COVID-19.

IV. Wreszcie, interes publiczny również zdecydowanie przemawia za wnioskowanym wstrzymaniem, ponieważ poprawa w zakresie dokładnego określenia podstawowych parametrów końcowych (i) będzie zgodna z najlepszymi praktykami naukowymi, (ii) zwiększy zaufanie społeczne do skuteczności produktu, który może być zlecany lub przeznaczony do powszechnego stosowania, oraz (iii) nieudzielenie zgody na wnioskowane wstrzymanie będzie miało odwrotny skutek i spowoduje niepewność co do skuteczności i zapotrzebowania na szczepionki COVID-19.

V. W związku z tym składający petycję z szacunkiem wzywają do niezwłocznego uwzględnienia niniejszego wniosku.

Z wyrazami szacunku składam niniejszą petycję w moim imieniu oraz w imieniu współskładającego petycję, dr. Michaela Yeadona:

__________________________________________________________

dr nauk med. Wolfgang Wodarg

Załącznik A

Załącznik B

Załącznik A

ZŁOŻONO DROGĄ ELEKTRONICZNĄ

25 listopada 2020

Division of Dockets Management

Department of Health and Human Services

Food and Drug Administration

Commissioner Stephen M. Hahn, M.D.

5630 Fishers Lane

Rm. 1061

Rockville, MD 20852

DEPARTAMENT ZDROWIA I OPIEKI SPOŁECZNEJ STANÓW ZJEDNOCZONYCH

ORAZ AGENCJA ŻYWNOŚCI I LEKÓW (FDA)

PETYCJA W SPRAWIE PODJĘCIA
DZIAŁAŃ ADMINISTRACYJNYCH W CELU
POTWIERDZENIA PUNKTÓW KOŃCOWYCH
SKUTECZNOŚCI BADAŃ KLINICZNYCH
III FAZY SZCZEPIONKI PRZECIWKO COVID-19

nr FDA-2020-P-2225

ADMINISTRACYJNE WSTRZYMANIE DZIAŁAŃ

    Niniejsza petycja w sprawie wstrzymania działań została złożona w imieniu dr. Sin Hang Lee (?Składający petycję?), zgodnie z 21 C.F.R. § 10.35 oraz powiązanych postanowień Federal Food, Drug and Cosmetic Act (Ustawy o żywności, lekach i kosmetykach) lub Public Health Service Act (Ustawy o służbie zdrowia) i ma na celu zwrócenie się do Komisarza ds. Żywności i Leków (?Komisarza?) o wstrzymanie Badań III fazy BNT162b (NCT04368728), zgodnie z wnioskami sformułowanymi poniżej, w sekcji ?wnioskowane działanie?.

Ze względu na palącą potrzebę zapewnienia bezpieczeństwa i skuteczności szczepionki przeciwko COVID-19, która miałaby zostać zatwierdzona przez FDA, jak również celem umożliwienia Składającemu petycję podjęcia kroków prawnych w razie odrzucenia przez Komisarza niniejszej petycji, Składający ją zwraca się do FDA o podjęcie działania do dnia 11 grudnia 2020.

1. DECYZJA, KTÓREJ PETYCJA DOTYCZY

1. Zatwierdzenie planu badania klinicznego III fazy BNT162 (NCT04368728)

1. WNIOSKOWANE DZIAŁANIA

1. Wstrzymanie badania klinicznego III fazy BNT162 (NCT04368728) do momentu, w którym jego plan zostanie poprawiony z zapewnieniem, że:

Zanim szczepionka firmy Pfizer lub jakakolwiek inna szczepionka dla której wyniki testów PCR stanowią podstawową metodę potwierdzania zakażenia otrzyma bezwarunkowe pozwolenie lub pozwolenie na użycie w sytuacji nagłej (EUA – Emergency Use Authorization), wszystkie ?punkty końcowe? czy też przypadki infekcji COVID-19, wykorzystane do potwierdzenia skuteczności szczepionki w badaniach fazy 3 i 2/3 powinny zostać potwierdzone jako faktyczne przypadki infekcji za pomocą sekwencjonowania metodą Sangera ze względu na wysokie wartości Ct zastosowane w niektórych testach. Powszechnie wiadomo, że wysokie wartości Ct w wynikach testów wykonywanych metodą RT-qPCR prowadzą do uzyskania fałszywie dodatnich wyników.

Wszyscy pacjenci, których wyniki testów RT-qPCR były dodatnie, byli klasyfikowani jako ?przypadki COVID-19? stanowiące punkty końcowe badania. Wyniki te powinny zostać zweryfikowane za pomocą sekwencjonowania metodą Sangera, aby potwierdzić, czy w badanych próbkach faktycznie znajdowały się fragmenty unikalnego RNA genomu SARS-CoV-2. Zgodnie z wymaganiami FDA dotyczącymi stwierdzenia obecności wirusa brodawczaka ludzkiego (HPV) z użyciem metody PCR, w elektroforegramie musi znaleźć się przynajmniej 100 kolejnych zasad pasujących do sekwencji referencyjnej, przy oczekiwanej wartości (wartości E) <10^-30 dla specyficznej dla SARS-CoV-2 sekwencji genów (w oparciu o przeszukiwanie bazy danych GenBank lub bazy nukleotydów NCBI metodą BLAST).

1. UZASADNIENIE

1. Jak wyjaśniono poniżej, (i) jeśli nie zostanie podjęta decyzja o wstrzymaniu, Składający petycję dozna nienaprawialnej szkody, (ii) wniosek jest poważny i został złożony w dobrej wierze, (iii) wniosek ma na celu ochronę interesu społecznego oraz (iv) wstrzymanie badań jest wskazane z punktu widzenia ochrony interesów publicznych. 

1. Obecnie obowiązujący plan badania fazy II/III BNT162 (?Szczepionki Pfizer?) nie pozwala na dokładną ocenę jej skuteczności.

1. Jeśli wnioskowane w niniejszej petycji działania nie zostaną podjęte, Składający petycję oraz społęczeństwo poniosą nienaprawialne szkody. Kiedy FDA wyda pozwolenie na stosowanie tej szczepionki przeciwko COVID-19, zarówno rządy jak i pracodawcy będą mogli wprowadzić obowiązek zastosowania tego produktu (ogólny lub np. w przypadku podróży samolotem czy podróży międzynarodowych), lub rekomendować szczepionkę do szerokiego zastosowania. Jeśli w trakcie prowadzenia badania ocena chory/zdrowy jest niedokładna, szczepionka nie będzie należycie sprawdzona. Jeżeli szczepionka nie będzie należycie sprawdzona, ważne decyzje dotyczące strategii jej zastosowania będą opierały się na wprowadzających w błąd danych. Trudno wyobrazić sobie poważniejsze konsekwencje natury medycznej i gospodarczej.

1. Izba Adwokacka Stanu Nowy Jork (The New York State Bar Association) wydała raport na temat COVID-19, w którym umieściła rekomendację, aby ?szczepionka, której bezpieczeństwo i skuteczność zostaną potwierdzone naukowymi dowodami, była szeroko dostępna, aby zachęcać do jej stosowania, a jeśli służby ochrony zdrowia uznają to za niezbędne – aby była wymagana??. Uzasadnione jest więc podejrzenie, że szczepienia przeciwko COVID-19, w tym również szczepionka firmy Pfizer, mogą stać się obowiązkowe. Jeśli FDA teraz nie zadba o wykonanie właściwych testów skuteczności tej szczepionki, zarówno Składający Petycję jak i szeroka publiczność mogą nie mieć możliwości odmowy przyjęcia szczepionki, zatwierdzonej jak na razie w oparciu o niekompletne i niewiarygodne dane z badania klinicznego. 

1. Ponadto, jeśli szczepionka zostanie zaakceptowana bez dokładnego i właściwego sprawdzenia jej skuteczności, każda decyzja o jej przyjęciu lub wprowadzeniu obowiązku jej stosowania będzie opierać się na nieadekwatnych dowodach, które jej dotyczą. Dowody te sugerują, że szczepionka zatrzyma transmisję wirusa z osoby zaszczepionej na innych i/lub że zmniejszy ona liczbę ciężkich przypadków COVID-19 i zgonów. Obecnie używany protokół badania firmy Pfizer nie ma na celu określenia, czy którykolwiek z tych celów uda się osiągnąć; a nawet gdyby protokół przewidywał uzyskanie takiej wiedzy, jeśli nie da się w wiarygodny sposób zidentyfikować przypadków infekcji, nie da się również wiarygodnie zrealizować tych celów.

1. Interes publiczny przemawia także na korzyść przyjęcia wnioskowanego rozwiązania, ponieważ dokładne określenie głównych punktów końcowych (i) będzie zgodne z dobrymi praktykami badań naukowych, (ii) zwiększy publiczne zaufanie co do skuteczności produktu, który z dużym prawdopodobieństwem będzie obowiązkowy lub szeroko rozpowszechniony, zaś (iii) niezrobienie tego przyniesie rezultat odwrotny i wywoła niepewność co do skuteczności i zasadności szczepień przeciwko COVID-19.

1. Zgodnie z protokołem badania, punkt ?8.1. Ocena skuteczności i/lub immunogenności?, głównym punktem końcowym badania jest zapobiegnięcie wystąpieniu objawowej infekcji u osób, które otrzymają szczepionkę. W celu oceny punktu końcowego, badanie przewiduje śledzenie zarejestrowanych infekcji COVID-19. Definicja potwierdzonego COVID-19 jest następująca:

Wystąpienie przynajmniej jednego z następujących objawów oraz dodatni wynik testu NAAT (nucleic acid amplification tests, testy wykorzystujące amplifikację kwasów nukleinowych) uzyskany w trakcie lub do 4 dni przed oraz do 4 dni po okresie występowania objawów; test wykonany w laboratorium centralnym lub w miejscowym centrum badań (z użyciem zaakceptowanego rodzaju testu):

• Gorączka;
• Wystąpienie lub nasilenie kaszlu;
• Wystąpienie lub nasilenie duszności;
• Dreszcze;
• Wystąpienie lub nasilenie bólu mięśni;
• Utrata węchu lub smaku;
• Ból gardła;
• Biegunka;
• Wymioty.

1. W związku z tym, jeśli uczestnik badania ma dodatni wynik testu RT-qPCR, a jednocześnie kaszle lub boli go gardło, będzie zakwalifikowany jako ?potwierdzony przypadek COVID-19? i zaliczony jako punkt końcowy badania. Kiedy badanie osiągnie pewną liczbę ?punktów końcowych?, będzie coraz bliższe uzyskania aprobaty lub zatwierdzenia ze strony FDA, ponieważ wykaże, że szczepionka jest ?skuteczna? (to znaczy, że w grupie badanej częstość występowania punktów końcowych była mniejsza niż w grupie kontrolnej).

1. To oznacza, że skuteczność szczepionki będzie określona wyłącznie na podstawie niespecyficznych objawów choroby występujących łącznie z dodatnim wynikiem laboratoryjnego testu PCR.

1. Zgodnie z protokołem badania, punkt ?8.1. Ocena skuteczności i/lub immunogenności?, skuteczność będzie oceniana przez cały czas uczestnictwa w badaniu poprzez monitorowanie ewentualnych przypadków COVID-19. Jeśli w którymkolwiek momencie u uczestnika badania rozwinie się ostra infekcja oddechowa (por. Sekcja 8.13), dla celów badania będzie on uznany za potencjalnie chorującego na COVID-19. W takim przypadku Uczestnik powinien skontaktować się z ośrodkiem badawczym, powinna odbyć się wizyta lekarska (osobiście lub w ramach teleporady), i powinny zostać poczynione dalsze ustalenia, jak przewiduje Harmonogram działań. Dalsze czynności obejmują pobranie wymazu ze środkowej małżowiny nosa, który następnie zostanie zbadany z użyciem metody RT-PCR (Cepheid, dopuszczony przez FDA w reżimie EUA – Emergency Use Authorization, pozwolenie na użycie w sytuacji nagłej) lub innym, ekwiwalentnym testem opartym na amplifikacji kwasów nukleinowych (NAAT), celem wykrycia obecności SARS-CoV-2. Ocenie zostaną poddane również informacje kliniczne oraz wyniki testów, które w danym miejscu są standardowo stosowane (co szczegółowo opisano w sekcji 8.13). Wynik testu NAAT z laboratorium centralnego będzie podstawą zdefiniowania przypadku, chyba, że nie jest dostępny wynik z laboratorium centralnego, wtedy można oprzeć się na wyniku testu NAAT wykonanego w miejscowym laboratorium, pod warunkiem, że uzyskano go z użyciem jednego z następujących zestawów:

• Cepheid Xpert Xpress SARS-CoV-2
• Roche cobas SARS-CoV-2 real-time RT-PCR test (EUA200009/A001)
• Abbott Molecular/Real Time SARS-CoV-2 assay (EUA200023/A001)

1. Testy wymienione w protokole badania klinicznego, to jest Cepheid Xpert Xpress SARS-CoV-2; Roche cobas SARS-CoV-2 real-time RT-PCR test (EUA200009/A001) i Abbott Molecular/Real Time SARS-CoV-2 assay (EUA200023/A001) są mało wiarygodnymi narzędziami do oceny, czy w próbce wymazu pobranego z nosa uczestnika badania, u którego wystąpiły objawy, jest wirus SARS-CoV-2 czy też nie. Testy te, real-time RT-PCR i RT-ilościowy PCR powinny być oznaczane odpowiednio rRT-PCR lub RT-qPCR, aby odróżnić je od konwencjonalnego RT-PCR. Bardzo krótkiego produktu RT-qPCR (amplikonu), w odróżnieniu od produktów konwencjonalnego PCR, nie da się poddać badaniu zautomatyzowanym sekwencjonowaniem metodą Sangera. Sekwencjonowanie DNA celem walidacji produktów PCR jest niezbędne do prawidłowej oceny, czy domniemany dodatni wynik RT-qPCR w kierunku SARS-CoV-2 jest prawdziwie czy fałszywie dodatni. Uzasadnienie jest następujące:

1. Obecnie sekwencjonowanie DNA amplikonu PCR genomowego kwasu nukleinowego patogenu jest ogólnie przyjętą technologią służącą do wykrywania i potwierdzania obecności czynników zakaźnych, zwłaszcza chorobotwórczych wirusów, w próbkach klinicznych. 10 stycznia 2020 została opublikowana online pierwsza sekwencja genomu SARS-CoV-2. Tego samego dnia zespół amerykańskich naukowców, w większości z CDC, natychmiast zaprojektował dwa komplementarne panele primerów służących do amplifikacji genomu wirusa do sekwencjonowania. Średnia wielkość amplikonów PCR w ich badaniu wynosiła 550 bp.
2. Wytyczne Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) zatytułowane ?Testy laboratoryjne WHO w kierunku choroby wywołanej koronawirusem (COVID-19) u pacjentów z jej podejrzeniem – wytyczne Interim z dnia 19 marca 2020? zalecały, aby ?Rutynowe potwierdzanie przypadków COVID-19 opierało się na wykrywaniu unikalnych sekwencji wirusowego RNA metodą NAAT, taką jak np. rRT-PCR, i było potwierdzane sekwencjonowaniem kwasów nukleinowych kiedy to konieczne?.
3. FDA również zdaje sobie sprawę z nieodłącznie związanej z testem RT-qPCR niedokładności. W swoim stanowisku wydanym 4 lutego 2020, zezwalającym na użycie w sytuacji awaryjnej panelu diagnostycznego Real-Time odwrotnej transkryptazy (RT)-PCR wykrywającego CDC 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV, później nazwany SARS-CoV-2), wyraźnie stwierdziła, że jest to panel testowy do ?domniemanej detekcji jakościowej kwasów nukleinowych z 2019-nCoV (sic) w próbkach z górnych i dolnych dróg oddechowych.?
4. Oprócz fałszywie ujemnych wyników, zestawy testowe RT-qPCR stosowane w reżimie EUA dają także wyniki fałszywie dodatnie. Na przykład wszystkie 77 dodatnich wyników testu na obecność SARS-CoV-2 wykonanych u grupy piłkarzy przy powtórnym badaniu okazało się być fałszywie dodatnich.
5. FDA oficjalnie ostrzegło pracowników laboratoriów i ochrony zdrowia o podwyższonym ryzyku uzyskania fałszywie dodatnich wyników w sytuacji gdy używa się dostępnych komercyjnie zestawów testowych dopuszczonych do użycia w reżimie EUA.
6. Sposobem FDA na rozwiązanie problemu niedokładnych testów jest powtórna analiza próbek, dla których otrzymano fałszywe wyniki za pomocą dodatkowego badania RT-qPCR w reżimie EUA i/lub sekwencjonowania metodą Sangera. Ponieważ jednak wynik dodatkowego badania EUA RT-qPCR może być fałszywy, sekwencjonowanie metodą Sangera jest de facto złotym standardem potwierdzającym domniemane jakościowe wykrywanie kwasu nukleinowego SARS-CoV-2 oraz wykluczającym przypadki wyników fałszywie dodatnich.
7. Zgodnie z wytycznymi FDA dotyczącymi diagnostyki molekularnej zakażenia wirusem brodawczaka ludzkiego (HPV) na uznane postępowanie diagnostyczne składają się kolejno: konwencjonalne wykrycie genomowego DNA metodą PCR, następnie sekwencjonowanie metodą Sangera obydwu nici amplikonu PCR (sekwencjonowanie dwukierunkowe), zawierającego minimum 100 sąsiadujących zasad. Jeśli sekwencja jest zgodna z sekwencją referencyjną lub sekwencją konsensusu, np. z wartością oczekiwaną E <10^-30 dla specyficznego dla HPV celu DNA w oparciu o wyszukiwanie metodą BLAST w bazie danych GenBank (NCBI Nucleotide), uznaje się to za wiarygodną metodę diagnostyczną infekcji HPV. W ślad za tymi wytycznymi FDA, wskazując na możliwość wdrożenia tych samych wytycznych dla dokładniejszej diagnostyki COVID-19, stworzono protokół dla potwierdzenia obecności SARS-CoV-2 w próbkach klinicznych, wykorzystujący amplikon cDNA gniazdowego PCR złożony z wysoko konserwowanego 398-zasadowego fragmentu genu N SARS-CoV-2 jako szablon do sekwencjonowania metodą Sangera.
8. Weryfikacja za pomocą sekwencjonowania DNA jest niezbędna do potwierdzenia przypadków uważanych za SARS-CoV-2 dodatnie w badaniu klinicznym fazy II/III szczepionki firmy Pfizer, ponieważ zgodnie z protokołem badania próbki pobierane od jego objawowych uczestników były wysyłane do centralnego laboratorium, które korzystało z testów opartych na reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR) (Cepheid; zaakceptowany przez FDA w reżimie EUA) lub innych, ekwiwalentnych testów opartych na amplifikacji kwasów nukleinowych (NAAT) do wykrywania SARS-CoV-2.

Aby podnieść czułość detekcji, minimalna wartość Ct w systemie Cepheid została wyznaczona na poziomie 42,9 dla genu N2 i 44,9 dla genu E, jak pokazuje Tabela 4 Instrukcji Użytkownika (Cepheid 302-3562, Rev. E Wrzesień 2020).

Tabela 4. Określenie granicy wykrywalności z użyciem materiału USA-WA1/2020

Materiał	Stężenie (PFU/mL)	Otrzymano ważnych wyników	% trafień	% trafień	Min. Wartość Ct	Min. Wartość Ct
gen N2	gen E	gen N2	gen E
Wirus SARS-CoV-2 (USA-WA1/2020)	0,0200	20	100	95,0	38,3	36,4
0,0050	22	95,5	68,2	40,5	39,1
0,0025	22	90,9	36,4	41,5	39,6
0,0010	22	50,0	18,2	42,0	42,0
0,0005	22	45,5	18,2	41,7	41,5
0,0003	22	18,2	4,5	42,1	44,9
0,0001	22	9,1	0	42,9	N/A
0	0	0	0	N/A	N/Aś

Przy wartościach Ct pomiędzy 36,0 a 44,9 wiele dodatnich wyników testów RT-qPCR to wyniki fałszywie dodatnie. 

1. Wyniki uzyskane za pomocą trzech rodzajów zestawów testów zaakceptowanych do badania nie są między sobą porównywalne. Próbka, która według testu Abbott powinna być zaklasyfikowana jako ujemna może dać wynik dodatni testu wykonanego zestawem Cepheid. Według badania przeprowadzonego przez FDA, granica wykrywalności dla testu Cepheid Xpert Xpress SARS-CoV-2 test i testu Abbott Real Time SARS-CoV-2 assay jest identyczna, określona jako 5400 jednostek wykrywalnych metodą NAAT/ml, jak pokazują dane z panelu referencyjnego FDA.

5400 Cepheid – Xpert Xpress SARS-CoV-2 test

5400 Abbott Molecular – Abbott Real Time SARS-CoV-2 assay

Jednakże, z powodu uznania testów o wyższej wartości cyklu granicznego (wartości Ct) za dodatnie, wiele przypadków, które w testach Abbott miały wynik ujemny, w testach Cepheid otrzymały wynik dodatni, co pokazuje badanie porównawcze head-to-head, zobrazowane danymi w tabeli 2 stanowiącej część raportu autorstwa Basu i in.

Tabela 2. Wyniki kolejnych próbek pobranych z nosogardzieli pochodzących z oddziału ratunkowego, testy na obecność RNA wirusa SARS-CoV-2 wykonano zarówno za pomocą zestawów Abbott ID NOW jak i Cepheid GeneXpert.

Nr próbki	Wynik testu Abbott IDNOW	Wynik testu Cepheid	N2 Ct	E Ct
1	Ujemny	Dodatni	43,1	0,0
2	Ujemny	Dodatni	40,7	37,0
3	Dodatni	Dodatni	32,4	29,0
4	Dodatni	Dodatni	32,3	30,3
5	Dodatni	Dodatni	18,2	16,2
6	Dodatni	Dodatni	31,6	28,5
7	Dodatni	Dodatni	35,1	31,3
8	Ujemny	Dodatni	44,1	0,0
9	Ujemny	Dodatni	44,3	0,0
10	Dodatni	Dodatni	29,7	27,1
11	Dodatni	Dodatni	27,6	26,2
12	Dodatni	Dodatni	19,7	17,5
13	Dodatni	Dodatni	18,6	16,2
14	Ujemny	Dodatni	36,3	33,3
15	Dodatni	Dodatni	23,7	26,5

1. Jeden z użytkowników testów Cepheid zgłosił ostatnio, że ?Narzędzia są obecnie ustawione przez producenta tak, aby interpretować dodatni wynik dla jednego genu jako dodatni wynik testu, przy bardzo słabej skuteczności amplifikacji (wysoka wartość Ct i/lub nietypowa krzywa). Jak na razie żaden z nich nie uzyskał potwierdzenia wyniku dodatniego w badaniu innym testem dotyczącym podobnych genów, mogą to więc być wyniki fałszywie dodatnie wynikające z szumu tła.?

1. Inna grupa użytkowników również stwierdziła, że dodatni wynik testu Cepheid dla niektórych próbek nie znajduje potwierdzenia w badaniu innymi testami. Opublikowali oni raport, w którym stwierdzili, że ?czułość testu Xpert Xpress SARS-CoV-2 wynosiła 100% (20 na 20), a specyficzność 80% (16 na 20). Jeśli chodzi o wartości Ct w teście GeneXpert, zaobserwowano, że próbki, w których nie doszło do amplifikacji genu E (np. Ct=0), a wartość Ct dla genu N2 była większa od 40, zostały uznane za dodatnie, podczas gdy w badaniu innym testem w systemie RT-PCR (Da An Gene) dawały wynik ujemny.?

14. Weryfikacja dodatnich wyników testów RT-qPCR jest absolutnie niezbędna w randomizowanym badaniu klinicznym kontrolowanym placebo, ponieważ de facto wśród uczestników dochodzi do odślepienia badania. Zgodnie z sekcją 8.13 protokołu badania klinicznego: Monitorowanie COVID-19 (wszyscy uczestnicy): ?Jeśli uczestnik zaobserwuje u siebie któryś z następujących objawów (niezależnie od ich prawdopodobnej etiologii i znaczenia klinicznego), otrzymuje instrukcję, aby natychmiast skontaktować się z ośrodkiem badawczym, a jeśli otrzyma potwierdzenie, jak najszybciej odbyć wizytę lekarską osobiście lub za pomocą telemedycyny?. Taki kontakt powoduje natychmiastowe wykonanie testu NAAT z użyciem zestawu Cepheid Rt-qPCR w laboratorium centralnym lub w laboratorium lokalnym z użyciem podobnej, zaakceptowanej przez badanie metody.

W chwili przystąpienia do badania uczestnicy zostali poinformowani, że każdemu z nich zostanie podana szczepionka przeciwko COVID-19 lub placebo (roztwór soli), nie informując uczestników kto należy do której grupy. Jednakże użytkownicy otrzymali jednocześnie informację, że szczepionka może wywołać następujące reakcje:

• Gorączka ? 39,0°C
• Zaczerwienienie lub obrzęk w miejscu podania obejmujący powierzchnię ponad 10 cm (? 20 jednostek urządzenia pomiarowego)
• Ostry ból w miejscu podania
• Ostrą reakcję ogólnoustrojową.

Jak powszechnie wiadomo zarówno szerokiej publiczności, jak i w szczególności poinformowanym uczestnikom badania klinicznego, domięśniowe podanie niewielkiej ilości jałowego roztworu soli nie wywołuje gorączki, miejscowego zaczerwienienia i obrzęku, ostrego bólu ani reakcji ogólnoustrojowej. Uczestnicy, którzy otrzymali placebo, intuicyjnie (lub racjonalnie) stwierdzą, że nie została im podana szczepionka i nie są chronieni przed COVID-19, ponieważ nie wystąpiła u nich żadna reakcja poszczepienna po podaniu iniekcji. W efekcie więcej uczestników, którzy otrzymali placebo niż tych, którzy otrzymali szczepionkę, zgłosi się do koordynatora kiedy zaobserwują u siebie nawet lekkie objawy takie jak ból gardła czy pojawienie się kaszlu z obawy przed tym, że mogą być chorzy na COVID-19. Koordynator musi wtedy sprawdzić zgłoszone objawy oraz zlecić wykonanie testu Cepheid RT-qPCR w laboratorium centralnym, zgodnie z Protokołem. W cięższych przypadkach testy mogą zostać wykonane w miejscowym laboratorium z użyciem zestawów Abbott lub Roche, ponieważ może zaistnieć potrzeba wykonania testu po przyjęciu do szpitala, a wiele szpitali zdaje sobie sprawę z dużego odsetka fałszywie dodatnich wyników generowanego przez testy Cepheid. Wyniki tych testów nie są porównywalne, ponieważ testy Cepheid, zakładając bardzo wysoką wartość Ct  (aż do 44,9) dla ?wykrywania RNA genomu SARS-CoV-2? wykazują tendencję do generowania większej ilości wyników fałszywie dodatnich w porównaniu z innymi testami. Większa liczba testów z wynikiem fałszywie dodatnim w grupie uczestników, która otrzymała placebo sztucznie podniesie skuteczność szczepionki jeśli wyniki testów nie będą weryfikowane poprzez sekwencjonowanie nukleotydów mające na celu wyeliminowanie wszystkich fałszywie dodatnich wyników.

1. W oparciu o raport MPR opublikowany 8 listopada 2020, w tej serii badania klinicznego w analizie mającej na celu potwierdzenie oceny skuteczności szczepionki stwierdzono tylko 180 potwierdzonych przypadków COVID-19. Jeśli Sponsor (BioNTech/Pfizer) nie jest w stanie przeprowadzić kontrolnego sekwencjonowania dla tych 180 próbek RNA, Składający petycję niniejszym oferuje natychmiastowe powtórne ich przebadanie za pomocą sekwencjonowania metodą Sangera oraz przesłanie danych z laboratorium, aby wspomóc FDA w ocenie. W ten sposób Sponsor nie będzie miał wymówki, aby nie zastosować złotego standardu – sekwencjonowania metodą Sangera – do walidacji punktów końcowych.

1. Podsumowując, w oparciu o publicznie dostępne dane naukowe i wytyczne FDA, wszystkie wyniki testów RT-qPCR wykrywających sekwencję genową SARS-CoV-2 muszą być traktowane jako domniemane. Uważa się, że zestawy testowe Cepheid wykrywające SARS-CoV-2 dają więcej wyników fałszywie dodatnich niż inne zestawy testowe zaakceptowane do użycia w reżimie EUA.

1. Pozostałości poddanych badaniom próbek, zakwalifikowanych jako SARS-CoV-2-dodatnie przy użyciu testu Cepheid GeneXpert lub jego odpowiednika, zgodnie z protokołem badania klinicznego Pfizer, muszą zostać poddane kolejnemu badaniu sekwencjonowaniem metodą Sangera aby potwierdzić, czy te domniemane pozytywne próbki faktycznie zawierają unikalną sekwencję genomową SARS-CoV-2. Tylko wtedy dodatnie wyniki testów Cepheid GeneXpert będą mogły być zaakceptowane jako właściwe składowe ?punktu końcowego?. Tylko w takim przypadku wystąpienie jednego niespecyficznego objawu łącznie z wynikiem testu laboratoryjnego będzie mogło być uznane za ważne potwierdzenie przypadku COVID-19 lub ?punktu końcowego?.

Zawieszenie działań pilnie potrzebne

1. Składający petycję poniesie nienaprawialne szkody, ponieważ kiedy tylko FDA wyda pozwolenie na stosowanie tej szczepionki przeciwko COVID-19, spodziewamy się wprowadzenia przez poszczególne Stany obowiązku jej stosowania. Jeśli FDA nie zapewni należytych badań nad szczepionką teraz, Składający petycję nie będzie miał możliwości sprzeciwienia się otrzymaniu szczepionki, popartej niewystarczającymi badaniami, w późniejszym czasie. 

1. Dla przykładu, Izba Adwokacka Stanu Nowy Jork (New York State Bar Association) podjęła niedawno uchwałę, w której rekomenduje, aby ?w przypadku, gdyby poziom odporności, konsensusem naukowym i medycznym został oceniony jako niewystarczający do kontrolowania rozprzestrzeniania się COVID-19 oraz ograniczenia zachorowalności i śmiertelności, należy wziąć pod uwagę nakaz i podjęcie działań przez poszczególne Stany.? Nakazanie stosowania szczepionki, a tym samym odmowa prawa do wyrażenia świadomej zgody, powoduje że jeszcze bardziej paląca staje się potrzeba zapewnienia, że bezpieczeństwo i skuteczność jakiejkolwiek szczepionki przeciwko COVID-19 jest poparte wieloma badaniami, odpowiednio monitorowanymi klinicznie celem wychwycenia wszystkich ewentualnych zdarzeń niepożądanych.

1. Ponadto, jeśli szczepionka zostanie zarejestrowana bez odpowiedniej oceny skuteczności oraz bez poprawy dokładnego określenia głównych punktów końcowych, każde jej wprowadzenie do użytku lub obowiązek stosowania może się opierać na nieprawdziwych przekonaniach dotyczących tej szczepionki, sugerujących, że zatrzyma ona transmisję wirusa z osoby zaszczepionej na innych lub że zmniejszy liczbę ciężkich przypadków COVID-19 i zgonów. Obecnie używany protokół badania firmy Pfizer nie określa, czy którykolwiek z tych celów uda się osiągnąć.

1. Niniejszy wniosek jest poważny i został złożony w dobrej wierze, ponieważ ma na celu poprawę naukowej rzetelności i wiarygodności badań nad szczepionką przeciwko COVID-19.

1. Interes publiczny przemawia także na korzyść przyjęcia wnioskowanego rozwiązania ponieważ zwiększenie dokładności określenia głównych punktów końcowych (i) będzie zgodne z dobrymi praktykami badań naukowych, (ii) zwiększy publiczne zaufanie co do skuteczności produktu, który z dużym prawdopodobieństwem będzie obowiązkowy, zaś (iii) niezrobienie tego przyniesie rezultat odwrotny i wywoła niepewność co do skuteczności i zasadności szczepień przeciwko COVID-19.

1. W związku z tym Składający petycję uprzejmie wnioskuje o przyjęcie niniejszej prośby w trybie natychmiastowym. 

Z wyrazami szacunku, petycję złożył

Dr Sin Hang Lee

Załącznik B

Zewnętrzna recenzja naukowa testu RTPCR wykrywającego SARS-CoV-2 ujawnia 10 głównych błędów naukowych na poziomie molekularnym i metodologicznym: konsekwencje dla wyników fałszywie dodatnich.

Pieter Borger(1 * ), Bobby Rajesh Malhotra (2), Michael Yeadon (3), Clare Craig (4), Kevin McKernan (5), Klaus Steger (6), Paul McSheehy (7), Lidiya Angelova (8), Fabio Franchi (9), Thomas Binder (10), Henrik Ullrich (11), Makoto Ohashi (12), Stefano Scoglio (13), Marjolein Doesburg-van Kleffens (14), Dorothea Gilbert (15), Rainer Klement (16), Ruth Schruefer (17), Berber W. Pieksma (18), Jan Bonte (19) Bruno H. Dalle Carbonare (20), Kevin P. Corbett (21), Ulrike Kämmerer (22) * Corresponding Author

ABSTRAKT

?W publikacji zatytułowanej ? Detection of 2019 new coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR? (Eurosurveillance 25 (8) 2020) autorzy przedstawiają procedurę diagnostyczną i protokół RT-qPCR do wykrywania i diagnostyki 2019-nCoV (obecnie znanego jako SARS-CoV-2), o których twierdzą, że są zwalidowane oraz że stanowią solidną metodologię diagnostyczną do stosowania w laboratoriach zdrowia publicznego.

W świetle wszystkich konsekwencji wynikających z tej publikacji dla społeczeństw na całym świecie, grupa niezależnych badaczy dokonało szczegółowej recenzji wspomnianego tekstu przedstawionego do publikacji, w którym

1) sprawdzono krzyżowo wszystkie elementy przedstawionego projektu testu, 2) zalecenia protokołu RT-qPCR zostały ocenione pod kątem dobrej praktyki laboratoryjnej, oraz 3) parametry zostały zbadane na podstawie odpowiedniej literatury naukowej z tej dziedziny.

Opublikowany protokół RT-qPCR do wykrywania i diagnostyki 2019-nCoV oraz tekst przedstawiony do publikacji obciążone są licznymi błędami technicznymi i naukowymi, w tym: niewystarczający schemat primerów, problematyczny i niewystarczający protokół RT-qPCR oraz brak dokładnej walidacji testu. Ani prezentowany test, ani sam tekst badania nie spełniają wymogów dopuszczalności do publikacji naukowej. Ponadto, nie wspomniano o poważnych konfliktach interesów autorów. Wreszcie,

bardzo krótki czas między złożeniem tekstu a przyjęciem go do publikacji (24 godziny) oznacza, że albo nie przeprowadzono tu systematycznego procesu recezji naukowej, albo jego jakość jest problematyczna.

Dostarczamy przekonujących dowodów na wiele naukowych nieścisłości, błędów i wad. Biorąc pod uwagę przedstawione tutaj niedoskonałości naukowe i metodologiczne, jesteśmy przekonani, że redakcja Eurosurveillance nie ma innego wyjścia, jak wycofać publikację ?.

Raport z recenzji Międzynarodowego Konsorcjum Naukowców w Dziedzinie Nauk Przyrodniczych (ICSLS) ? Corman, Drosten i inni, Eurosurveillance 2020 (zaktualizowano dnia 29.11.2020)

ZWIĘZŁY RAPORT Z RECENZJI

Niniejsza praca pokaże wiele poważnych wad w pracy Cormana i Drostena, których znaczenie doprowadziło całym świecie do nieprawidłowego rozpoznawania zakażeń przypisywanych SARS-CoV-2 oraz związanych z chorobą COVID-19. Jesteśmy konfrontowani z rygorystycznym zamykaniem gospodarki, co zniszczyło życie i odebrało źródła utrzymania wielu ludziom, ograniczyło dostępem do edukacji, a narzucone przez rządy na całym świecie ograniczenia stanowią bezpośredni atak na podstawowe prawa ludzi i ich wolności osobiste, powodując dodatkowe szkody dla całego życia gospodarczego w skali globalnej.

Istnieje dziesięć fatalnych w skutkach problemów związanych z artykułem Cormana i Drostena, które przedstawimy i wyjaśnimy bardziej szczegółowo w kolejnych rozdziałach.

Pierwszą i najważniejszą kwestią jest to, że nowy koronawirus SARS-CoV-2 (w publikacji nazwany 2019-nCoV oraz w lutym 2020 roku nazwany SARS-CoV-2 przez międzynarodowe konsorcjum ekspertów ds. wirusów) oparty jest na sekwencjach in silico (teoretycznych), dostarczonych przez laboratorium w Chinach [1], ponieważ w tym czasie autorzy nie mieli dostępu do kontrolnego materiału zakaźnego (?żywego?) czy unieszkodliwionego SARS-CoV-2, ani też izolowanego genomowego RNA z wirusa. Do chwili obecnej autorzy nie przeprowadzili walidacji na podstawie wyizolowanych wirusów SARS-CoV-2 lub ich pełnowymiarowego RNA. Według Cormana i innych:

?Naszym celem było opracowanie i wdrożenie solidnej metodologii diagnostycznej do stosowania w warunkach laboratoriów zajmujących się zdrowiem publicznym, bez dostępu do materiału wirusowego?. [1]

W tym miejscu należy skoncentrować się na dwóch podanych celach: a) rozwoju i b) dystrybucji testów diagnostycznych do użytku w warunkach laboratoriów zajmujących się zdrowiem publicznym. Cele te nie są możliwe do osiągnięcia bez dostępu do jakiegokolwiek dostępnego materiału wirusowego (np. w celu określenia zakaźnego ładunku wirusowego). W każdym przypadku, tylko protokół o maksymalnej dokładności może być obowiązkowym i podstawowym celem w realizacji scenariusza o takiej skali. Określenie krytycznego obciążenia wirusowego jest informacją obowiązkową i grupa Christiana Drostena ponosi odpowiedzialność za przeprowadzenie takich eksperymentów i dostarczenie kluczowych danych.

Niemniej jednak, sekwencje in silico zostały wykorzystane do opracowania metodologii testu RT-PCR w celu zidentyfikowania wyżej wymienionego wirusa. Model ten opierał się na założeniu, że nowy wirus jest bardzo podobny do SARS-CoV z 2003 roku, ponieważ oba wirusy są beta-koronawirusami.

Test PCR został więc zaprojektowany z wykorzystaniem genomowej sekwencji SARS-CoV jako materiału kontrolnego dla składnika Sarbeco; wiemy to z naszej własnej komunikacji mailowej z [2] jednym ze współautorów artykułu Cormana i Drostena. Ta metoda modelowania SARS-CoV-2 została opisana w pracy Cormana i Drostena w następujący sposób:

?ustanowienie i walidacja przepływu pracy diagnostycznej dla badań przesiewowych 2019-nCoV i specyficznego potwierdzenia, zaprojektowanego przy braku dostępnych izolatów wirusa lub oryginalnych próbek od pacjentów. Projektowanie i walidacja były możliwe dzięki ścisłemu powiązaniu genetycznemu z SARS-CoV z 2003 roku i wspomagane poprzez zastosowanie technologii syntetycznego kwasu nukleinowego?.

Reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR) jest ważną technologią biomolekularną służącą do szybkiego wykrywania rzadkich fragmentów RNA, które są znane z wyprzedzeniem. W pierwszym etapie, cząsteczki RNA obecne w próbce są odwrotnie transkrybowane w celu uzyskania cDNA. Następnie cDNA jest amplifikowane w reakcji łańcuchowej polimerazy przy użyciu specyficznej pary starterów i enzymu polimerazy DNA, który jest termostabilny. Technologia ta jest bardzo czuła, a jej granicę wykrywalności stanowi teoretycznie 1 cząsteczka cDNA. Błędy w konstrukcji biomolekularnej mają duży wpływ na specyfikę PCR.

Co jest istotne podczas projektowania testu RT-PCR i ilościowego testu RT-qPCR opisanego w publikacji Cormana i Drostena?

1. Startery i próbniki:

a) stężenie starterów i próbników musi mieć optymalny zakres (100-200 nM);

b) muszą być swoiste dla genów docelowych, które chcemy amplifikować;

c) muszą mieć optymalny udział procentowy GC w stosunku do całkowitej zawartości zasad azotowych (minimum 40%, maksimum 60%);

d) w przypadku diagnostyki wirusowej co najmniej 3 pary starterów muszą wykryć 3 geny wirusa (najlepiej jak najbardziej od siebie oddalone w genomie wirusa).

2. Temperatura, w której zachodzą wszystkie reakcje:

a) temperatura topnienia DNA (>92°)

b) temperatura amplifikacji DNA (zależna od TaqPol)

c) Tm; temperatura wyżarzania (temperatura, przy której startery i próbniki osiągają docelowe wiązanie/odczepienie, nie może przekraczać 2 ?C na parę starterów). Tm w dużym stopniu zależy od zawartości GC w starterach.

3. Liczba cykli amplifikacji (mniej niż 35; najlepiej 25-30 cykli);

W przypadku wykrywania wirusa, >35 cykli wykrywa tylko sygnały, które nie korelują z wirusem zakaźnym, określonym przez wyizolowanie w hodowli komórkowej [zweryfikowane w 2]; jeśli ktoś jest badany metodą PCR i uzyska wynik dodatni, gdy stosowany jest próg 35 cykli lub wyższy (jak w większości laboratoriów w Europie i USA), prawdopodobieństwo, że dana osoba jest faktycznie zakażona jest mniejsze niż 3%, a prawdopodobieństwo, że dany wynik jest fałszywie dodatni wynosi 97% [zweryfikowane w 3].

4. Biologiczne walidacje molekularne; amplifikowane produkty PCR muszą być walidowane albo poprzez sprawdzenie produktów w żelu z wystandaryzowanym DNA do porównywania z badanym materiałem genetycznym [DNA ruler], albo poprzez bezpośrednie sekwencjonowanie DNA

5. Należy określić kontrole dodatnie i ujemne w celu potwierdzenia/odrzucenia wykrycia konkretnego wirusa

6. Powinna być dostępna Standardowa Procedura Operacyjna (SPO)

SPO jednoznacznie określa powyższe parametry, dzięki czemu wszystkie laboratoria są w stanie ustawić dokładnie takie same warunki badania. Posiadanie zwalidowanej uniwersalnej SPO jest niezbędne, ponieważ umożliwia porównanie danych w obrębie i pomiędzy krajami.

POMNIEJSZE OBAWY ZWIĄZANE Z ARTYKUŁEM CORMANA I DROSTENA   

1. W tabeli 1 w pracy Cormana i Drostena podano różne skróty ? podano ?nM?, a nie podano ?nm?. Ponadto, w odniesieniu do prawidłowego nazewnictwa, nm oznacza ?nanometr?, dlatego też ?nm? należy odczytywać tutaj jako ?nM?.

2. Panuje ogólna zgoda co do tego, że sekwencje genetyczne należy pisać zawsze w kierunku 5′-3′, łącznie ze starterami odwrotnymi. Wysoce niespotykane jest uzgadnianie z zapisem odwrotnej komplementarnej sekwencji starterów, jak zrobili to autorzy na rysunku 2 w pracy Cormana i Drostena. W tym przypadku, dodatkowo, chwiejna podstawa jest oznaczona jako ?y? bez opisu podstaw, które to Y oznacza.

3. Artykuł Cormana i Drostena zawiera dwie wprowadzające w błąd pułapki: Tabela 1 nie zawiera wartości Tm (wartości temperatury przyłączania primerów), ani wartości GC (liczba G i C w sekwencjach jako wartość procentowa baz ogółem).

GŁÓWNE OBAWY ZWIĄZANE Z ARTYKUŁEM CORMAN I DROSTENA

A) WPROWADZENIE

Autorzy przedstawiają tło dla swojej pracy naukowej jako: ?Trwający obecnie wybuch pandemii nowego koronawirusa (2019-nCoV) stanowi wyzwanie dla laboratoriów zajmujących się zdrowiem publicznym, jako że izolaty wirusa są niedostępne, podczas gdy rośnie liczba dowodów na to, że ognisko jest bardziej powszechne niż początkowo sądzono, a już dochodzi do rozprzestrzeniania się na skalę międzynarodową przez podróżnych?.

Według BBC News [4] i Google Statistics [5] w dniu 21 stycznia 2020 roku na całym świecie odnotowano 6 zgonów ? w dniu nadesłania artykułu do publikacji. Dlaczego autorzy założyli, że istnieje wyzwanie dla laboratoriów zajmujących się zdrowiem publicznym, gdy w tamtym czasie nie było istotnych dowodów wskazujących, że epidemia była bardziej powszechna niż początkowo sądzono?

Jako cel autorzy zadeklarowali opracowanie i wdrożenie solidnej metodyki diagnostycznej do stosowania w laboratoriach zajmujących się zdrowiem publicznym bez dostępu do materiału wirusowego. Ponadto autorzy przyznają, że ?niniejsze badanie pokazuje ogromną zdolność reagowania, osiągniętą dzięki koordynacji laboratoriów akademickich i publicznych w krajowych i europejskich sieciach badawczych?.

B) METODY I WYNIKI

1. Projektowanie starterów i próbników

1a) Błędne stężenia startera

Niezawodne i dokładne protokoły testu PCR są zazwyczaj projektowane z użyciem od 100 nM do 200 nM na starter [7]. W pracy Cormana i Drostena w przypadku kilku starterów zaobserwowano niezwykle wysokie i zmienne stężenia starterów (Tabela 1). Dla par starterów RdRp_SARSr-F i RdRp_SARSr-R opisano odpowiednio 600 nM i 800 nM. Podobnie dla zestawu starterów N_Sarbeco_F i N_Sarbeco_R zalecono odpowiednio 600 nM i 800 nM [1].

Powinno być jasne, że te stężenia są zdecydowanie za wysokie, by stanowiły poziom optymalny do swoistego amplifikowania docelowych genów. Nie ma żadnego konkretnego powodu, aby używać te ekstremalnie wysokie startery w tym protokole. Stężenia te prowadzą raczej do zwiększenia wiązań niespecyficznych i amplifikacji produktu PCR.

Tabela 1: Startery i próbniki (zaadaptowane z artykułu Cormana i Drostena; zaznaczono błędne stężenia startera)

Oznaczenie/użycie	Oligonukleotydy	Sekwencjaa	Koncentracjab
Gen RdRP	RdRp_SARSr-F	GTGARATGGTCATGTGTGGCGG	Stosować 600 nM na reakcję
RdRp_SARSr-P2	FAM-CAGGTGGAACCTCATCAGGAGATGC-BBQ	Specyficzna dla 2019-nCoV, nie wykryje SARS-CoV. Stosować 100 nM na reakcję i mieszać z P1.
RdRP_SARSr-P1	FAM-CCAGGTGGWACRTCATCMGGTGATGC-BBQ	Pan Sarbeco-Probe wykryje 2019-nCoV, SARS-CoV oraz koronawirusy SARS pochodzące od nietoperzy Stosować 100 nM na reakcję i mieszać z P2
RdRp_SARSr-R	CARATGTTAAASACACTATTAGCATA	Stosować 800 nM na reakcję
Gen E	E_Sarbeco_F	ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT	Stosować 400 nm na reakcję
E_Sarbeco_P1	FAM-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-BBQ	Stosować 200 nm na reakcję
E_Sarbeco_R	ATATTGCAGCAGTACGCACACA	Stosować 400 nm na reakcję
Gen N	N_Sarbeco_F	CACATTGGCACCCGCAATC	Stosować 600 nm na reakcję
N_Sarbeco_P	FAM-ACTTCCTCAAGGAACAACATTGCCA-BBQ	Stosować 200 nm na reakcję
N_Sarbeco_R	GAGGAACGAGAAGAGGCTTG	Stosować 800 nm na reakcję

^a W oznacza A/T; R oznacza G/A; M oznacza A/C; S oznacza G/C. FAM: 6-karboksyfluoresceina; BBQ: Blackberry quencher.

^b Optymalne stężenia podano w nanomolu na litr (nM) w oparciu o końcową mieszaninę reakcyjną, np. 1,5 ?L 10 ?M roztworu podstawowego startera na 25 ?L całkowitej objętości reakcji daje końcowe stężenie 600 nM, jak wskazano w tabeli.

1b) Niesprecyzowane (?chwiejne?) sekwencje startera i próbnika

Aby uzyskać powtarzalne i porównywalne wyniki, konieczne jest wyraźne określenie par starterów. W artykule Cormana i Drostena zaobserwowaliśmy sześć nieokreślonych pozycji, oznaczonych literami R, W, M i S (Tabela 2). Litera W oznacza, że na tej pozycji może być A lub T; R oznacza, że może być tam G lub A; M oznacza, że może tam znajdować się A lub C; litera S oznacza, że na tej pozycji może znajdować się G lub C. Ta duża liczba wariantów jest nie tylko niezwykła, ale również bardzo myląca dla laboratoriów. Te sześć nieokreślonych pozycji może łatwo doprowadzić do zaprojektowania kilku różnych alternatywnych sekwencji startowych, które nie mają związku z SARS-CoV-2 (2 różne startery RdRp_SARSr_F + 8 różnych próbników RdRp_SARS_P1 + 4 różne RdRp_SARSr_R). Zmiany konstrukcyjne nieuchronnie doprowadzą do uzyskania wyników, które nie są nawet związane z SARS CoV-2. Dlatego też mylący, niesprecyzowany opis zawarty w artykule Cormana i Drostena nie jest odpowiedni jako standardowy protokół postępowania. Te niesprecyzowane pozycje powinny były zostać jednoznacznie zaprojektowane.

Te chwiejne sekwencje stały się już źródłem niepokoju w tym obszarze i zaowocowały Listem do Redakcji autorstwa Pillonela i innych [8] dotyczącym rażących błędów w opisanych sekwencjach. Błędy te oczywiście pojawiły się również w suplemencie autorstwa Cormana i innych.

Tabela 2: Startery i próbniki (zaadaptowane z artykułu Cormana i Drostena; nieokreślone (?chwiejne?) nukleotydy w starterach zostały zaznaczone)

[tłumaczenie tabeli powyżej, skopiowano w celu pokazania zaznaczeń]

W protokole WHO (Rysunek 1), który pochodzi bezpośrednio z pracy Cormana i Drostena, stwierdza się, że w celu potwierdzenia obecności SARS-CoV-2, w badaniu należy zidentyfikować dwa geny kontrolne (geny E? i RdRp). Należy zauważyć, że gen RdPd? ma jedną niepewną pozycję (?chwiejną?) w materiale starterowym typu forward primer (starter przedni) (R=G/A), dwie niepewne pozycje w materiale starterowym typu reverse primer (starter wsteczny) (R=G/A; S=G/C) oraz trzy niepewne pozycje w próbniku RdRp (W=A/T; R=G/A; M=A/C). Tak więc można zsyntetyzować dwa różne startery przednie, cztery różne startery wstecznei osiem różnych starterów dla generatora RdPd-. W sumie możliwe są 64 kombinacje starterów i próbników!

Artykuł Cormana i Drostena identyfikuje dalej trzeci gen, który, zgodnie z protokołem WHO, nie został później zwalidowany i uznany za zbędny:

?Warto zauważyć, że test na geny N również wypadł dobrze, ale nie został poddany dalszej intensywnej walidacji, ponieważ był nieco mniej wrażliwy?

Było to niefortunne przeoczenie, ponieważ najlepiej byłoby użyć wszystkich trzech genów PCR jako testów potwierdzających, a to doprowadziłoby do prawie wystarczającego protokołu narzędzia diagnostycznego do wykrywania RNA wirusa. Trzy etapy testów potwierdzających pozwoliłyby co najmniej na zminimalizowanie błędów i niepewności na każdym etapie w odniesieniu do ?chwiejnych? punktów. (Niemniej jednak, protokół nadal nie zawierałby żadnych ?dobrych praktyk laboratoryjnych? w zakresie uwzględniania wszystkich innych błędów projektowych).

W obecnej postaci, niestety, test na geny N nie jest ani proponowany w zaleceniach WHO (Rysunek 1) jako obowiązkowy i kluczowy trzeci etap potwierdzający, ani nie jest podkreślany w pracy Cormana i Drostena jako ważne opcjonalne zabezpieczenie ?rutynowego przebiegu pracy? (Tabela 2). 

W związku z tym, w prawie wszystkich procedurach przeprowadzania testów na świecie, zamiast wszystkich trzech zastosowano tylko 2 dopasowania startera. To niedopatrzenie sprawia, że cały protokół testowy jest bezużyteczny, jeśli chodzi o dostarczanie dokładnych wyników testów o rzeczywistym znaczeniu w czasach trwającej pandemii.

Rysunek 1: Test potwierdzający N-Gene ani nie jest wyróżniany jako niezbędny trzeci krok w oficjalnym zaleceniu protokołu WHO Drostena i Cormana poniżej [8], ani nie jest wymagany jako kluczowy krok w celu zwiększenia dokładności testu w publikacji Eurosurveillance.

Tło

Użyliśmy znanych koronawirusów związanych z SARS i SARS (wirusy nietoperzy z naszych własnych badań oraz z piśmiennictwa naukowego), aby wygenerować nieredundantne dopasowanie (fragmenty przedstawione w załączniku). Zaprojektowaliśmy kandydatóww na testy diagnostyczne RT-PCR przed uwolnieniem pierwszej sekwencji 2019-nCoV. Po uwolnieniu sekwencji wybrano następujące testy na podstawie ich dopasowania do 2019-nCoV, zgodnie z kontrolą dopasowania sekwencji i oceną wstępną (Rysunki 1 i 2).

Wszystkie testy mogą wykorzystywać genomowy RNA SARS-CoV jako kontrolę dodatnią. Syntetyczne RNA kontrolne dla testu genów 2019-nCoV E jest dostępna poprzez EVAg. Syntetyczna kontrola dla 2019-nCoV RdRp ma być dostępna przez EVAg od 21 stycznia.

Test przesiewowy pierwszej linii: test na geny E

Test potwierdzający: test genowy RdRp

1c) Błędna zawartość GC (omówiona w 2c, wraz z temperaturą wyżarzania (Tm))

1d) Wykrywanie genów wirusowych

RT-PCR nie jest zalecany do pierwotnej diagnostyki zakażeń. Dlatego test RT-PCR stosowany w rutynowych badaniach klinicznych do wykrywania COVID-19 nie jest wskazany do rozpozanwania przypadków COVID-19 jako prawnie usankcjonowane narzędzie diagnostyczne.

?Pracownicy kliniczni muszą uznać zwiększoną dokładność i szybkość technik diagnostyki molekularnej w diagnostyce zakażeń, ale także zrozumieć ich ograniczenia. Wyniki badań laboratoryjnych powinny być zawsze interpretowane w kontekście obrazu klinicznego pacjenta, a do uzyskania wiarygodnych wyników badań niezbędne jest odpowiednie miejsce, jakość i czas pobrania próbki?. [9]

Może być jednak stosowany jako pomoc w diagnostyce różnicującej, kiedy lekarz musi rozróżnić infekcje płuc (grypa, Covid-19 i SARS mają bardzo podobne objawy). W celu potwierdzenia rozpoznania specyficznego wirusa należy zastosować co najmniej 3 specyficzne pary starterów, aby wykryć 3 geny specyficzne dla wirusa. Najlepiej, aby te docelowe geny były zlokalizowane w jak największej odległości od siebiew genomie wirusa (w tym, na przeciwległych końcach).

Chociaż artykuł Cormana i Drostena opisuje 3 startery, to startery te pokrywają tylko około połowy genomu wirusa. Jest to kolejny czynnik zmniejszający specyficzność wykrywania nienaruszonego RNA wirusa COVID-19 i zwiększający liczbę fałszywie dodatnich wyników testów.

Dlatego, nawet jeśli otrzymamy trzy dodatnie sygnały (tzn. trzy pary starterów dają 3 różne produkty amplifikacji) w próbce, nie dowodzi to obecności wirusa. Lepsze zaprojektowanie startera pozwoliłoby uzyskać terminalne startery na obu końcach genomu wirusa. Wynika to z faktu, że cały genom wirusa zostałby objęty, a trzy dodatnie sygnały pomagają lepiej rozróżnić pomiędzy kompletnym (i tym samym potencjalnie zakaźnym) genomem wirusa a fragmentarycznymi genomami wirusa (bez zdolności zakaźnej). Aby wywnioskować cokolwiek istotnego na temat zakaźności wirusa jako cel należało uwzględnić gen Orf1, który koduje niezbędny enzym replikazy wirusów SARS-CoV (Rysunek 2). Kolejną słabością protokołu jest umiejscowienie celów w regionie genomu wirusa, który jest transkrybowany najsilniej i w najbardziej zróżnicowany sposób.

Kim i inni wykazują wysoce zmienną 3′ ekspresję subgenomicznego RNA w przypadku Sars-CoV-2 [23]. Te RNA są aktywnie monitorowane jako sygnatury dla chorych bezobjawowych i pacjentów niezakaźnych [10]. Wysoce wątpliwe jest badanie przesiewowe populacji osób bezobjawowych z użyciem starterów qPCR, które mają 6 par zasadowych w ramach dimeryzacji starterów na 3 starterze (Rysunek 3).

Najwyraźniej WHO zaleca stosowanie takich starterów. Wszystkie chwiejne pochodne z artykułu Cormana i Drostena przetestowaliśmy za pomocą narzędzia Thermofisher’s primer dimer web [sieć do dimeryzacji starterów Thermofishera] [11]. Starter przedni RdRp wykazuje homologię 6bp 3prime z Sarbeco E Reverse. Przy wysokich stężeniach startera jest to wystarczające do powstawania nieścisłości.

Uwaga: Istnieje idealne dopasowanie jednego ze starterów N do klinicznego patogenu (Pantoea), występującego u pacjentów z obniżoną odpornością. Odwrotny starter trafia również w Pantoea, ale nie w tym samym obszarze (Rysunek 3).

Są to poważne błędy projektowe, ponieważ test nie jest w stanie odróżnić całego wirusa od fragmentów wirusa. Test nie może być stosowany jako narzędzie diagnostyczne dla wirusów SARS.

Rysunek 2: Względne pozycje celów amplikonu na koronawirusie SARS i nowym genomie koronawirusa z 2019 roku. ORF: otwarta ramka odczytu; RdRp: polimeraza RNA zależna od RNA. Liczby poniżej amplikonu są pozycjami genomu zgodnie z SARS-CoV, NC_004718 [1];

[Nie uwzględnione w teście RT-PCR Cormana i Drostena / E: gen białka kopertowego; M: gen białka membranowego / N: gen białka nukleokapsydu / ORF: otwarta rama odczytu / RdRp: gen polimerazy RNA zależnej od RNA / S: gen białka kolcowego / Liczby poniżej amplikonu są pozycjami genomu zgodnie z SARS-CoV, NC_004718]

Rysunek 3: Test z użyciem narzędzia zwanego siecią do dimeryzacji starterów Thermofishera pokazuje, że starter przedni RdRp ma homologię 6bp 3`prime z Sarbeco E Reverse (lewa ramka). Inny test pokazuje, że jeden z starterów N idealnie pasuje do patogenu klinicznego (Pantoea) występującego u pacjentów z obniżoną odpornością (prawa ramka).

[krzyżowe startery  forward: / szczep Pantoea agglomerans chromosomu ASB05, pełen genom / ID sekwencji: CP045722.1 / długość: 4022781 / liczba dopasowań: 2 / Zakres 1: 2326019 do 2326037 / wynik: 38,2 bitów(19) / oczekiwany: 2,2 / zidentyfikowano: 19/19(100%) / braków: 0/19 (0%) / nić: Plus/Plus / zapytań: 1 / temat: 2326019]

2. Temperatura reakcji

2a) Temperatura topnienia DNA (>92°).

Odpowiednio omówione w pracy Cormana i Drostena.

2b) Temperatura amplifikacji DNA.

Odpowiednio omówione w pracy Cormana i Drostena.

2c) Błędne wartości GC i Tm

Temperatura przyłączania primerów określa, w jakiej temperaturze starter dołącza/odczepia się od sekwencji docelowej. Dla wydajnej i specyficznej amplifikacji, zawartość GC w starterach powinna osiągnąć co najmniej 40% i co najwyżej 60% amplifikacji. Jak wskazano w tabeli 3, trzy spośród starterów opisanych w pracy Cormana i Drostena nie mieszczą się w normalnym zakresie zawartości GC. Dwa startery (RdRp_SARSr_F i RdRp_SARSr_R) mają nietypowe i bardzo niskie wartości GC wynoszące 28%-31% dla wszystkich możliwych wariantów podstaw chwiejnych, natomiast starter E_Sarbeco_F ma wartość GC wynoszącą 34,6% (Tabela 3 i drugi segment w Tabeli 3).

Należy zauważyć, że zawartość GC w dużej mierze determinuje wiązanie z konkretnym celem ze względu na trzy wiązania wodorowe w parach podstawowych. Tak więc, im niższa jest zawartość GC w starterze, tym mniejsza jest jego zdolność do wiązania się z jego specyficzną docelową sekwencją genów (tj. genem, który ma być wykryty). Oznacza to, że aby rozpoznać docelową sekwencję musimy wybrać temperaturę jak najbardziej zbliżoną do rzeczywistej temperatury przyłączania primerów (wartości zgodnej z najlepszą praktyką), aby starter nie oderwał się ponownie, a jednocześnie musimy wybrać sekwencję docelową.

Jeśli wartość Tm jest bardzo niska, jak zaobserwowano we wszystkich chwiejnych wariacjach starterów odwróconych RdRp, startery mogą wiązać się niespecyficznie z kilkoma celami, zmniejszając specyficzność i zwiększając potencjalne fałszywe wyniki dodatnie.

Temperatura wyżarzania (Tm) jest kluczowym czynnikiem w określaniu specyficzności/dokładności procedury qPCR i jest niezbędna do oceny dokładności protokołów qPCR. Zalecenia dotyczące najlepszych praktyk: oba startery (przedni i wsteczny) powinny mieć niemal podobną, a najlepiej identyczną wartość.

Wykorzystaliśmy dostępne bezpłatnie oprogramowanie do projektowania starterów Primer-BLAST [12, 25] do oceny wartości najlepszych praktyk w odniesieniu do wszystkich starterów używanych w artykule Cormana i Drostena (Tabela 3). Staraliśmy się znaleźć wartość Tm na poziomie 60° C, szukając jednocześnie najwyższej możliwej wartości procentowej GC dla wszystkich starterów. Za akceptowalną uznano maksymalną różnicę Tm wynoszącą 2° C w parach starterów. Badając pary starterów określone w pracy Cormana i Drostena, zaobserwowano różnicę w wysokości 10° C w odniesieniu do temperatury wyżarzania Tm dla pary starterów1 (RdRp_SARSr_F i RdRp_SARSr_R). Jest to bardzo poważny błąd, który sprawia, że protokół jest bezużyteczny jako specyficzne narzędzie diagnostyczne.

Dodatkowe testy wykazały, że tylko para starterów przeznaczona do amplifikowania genu N (N_Sarbeco_F i N_Sarbeco_R) osiągnęła odpowiedni standard do pracy w teście diagnostycznym, ponieważ posiada wystarczającą zawartość GC, a różnica Tm pomiędzy starterami (N_Sarbeco_F i N_Sarbeco_R) wynosi 1,85° C (poniżej kluczowej maksymalnej różnicy temperatury w wysokości 2° C). Co ważne, jest to gen, który nie został przetestowany w próbkach wirusa (Tabela 2), ani wyróżniony jako test potwierdzający. Poza wysoce zmiennymi temperaturami topnienia i sekwencjami degeneracji w tych starterach, istnieje jeszcze jeden czynnik wpływający na specyficzność procedury: dNTP (0,4uM) są 2 razy wyższe niż zalecane dla wysoce specyficznej amplifikacji. Do reakcji dodawany jest również dodatkowy siarczan magnezu. Ta procedura w połączeniu z niską temperaturą przyłączania primerów może powodować niespecyficzne amplifikacje. Gdy do qPCR wymagany jest dodatkowy magnez, należy dokładniej zbadać specyficzność testu.

Opisane tu błędy projektowe są tak poważne, że jest bardzo mało prawdopodobne, aby doszło do specyficznej amplifikacji materiału genetycznego SARS-CoV-2 przy  zastosowaniu protokołu z artykułu Cormana i Drostena.

Tabela 3: Zawartość GC starterów i próbników (zaczerpnięta z artykułu Cormana i Drostena; podkreślono aberracje // odstępstwa od zoptymalizowanych zawartości GC. Drugi segment pokazuje tabelę z wykazem wszystkich najlepszych praktyk dla wszystkich starterów i próbników zastosowanych w artykule Cormana i Drostena przez prof. dr Ulrike Kämmerer i jej zespół.

[tłumaczenie górnej części tabeli wcześniej w dokumencie | przeszukiwanie w MN908947 (pierwszy pełny genom z Wuhan, 12.01.2020) pary starterów / sekwencje 5?-3? / matryca / długość / start / stop / Tm / %GC / komplementarność własna 5? / komplementarność własna 3? / długość produktu (bp) / do dodania w kolejnej wersji / nie odnaleziono w sekwencji / próbniki]

3. Liczba cykli amplifikacji

Należy zauważyć, że nigdzie w pracy Cormana i Drostena nie ma wzmianki o tym, że test jest dodatni lub ujemny, ani o tym, co określa wynik dodatni lub ujemny. Te rodzaje wirusologicznych testów diagnostycznych muszą być oparte na SPO, włączając zatwierdzoną i stałą liczbę cykli PCR (wartość Ct), po których próbka jest uznawana za dodatnią lub ujemną. Maksymalna racjonalnie wiarygodna wartość Ct wynosi 30 cykli. Powyżej wartości Ct wynoszącej 35 cykli należy spodziewać się szybko rosnącej liczby wyników fałszywie dodatnich.

Dane PCR ocenione jako dodatnie po wartości Ct wynoszącej 35 cykli są całkowicie niewiarygodne.

Cytując Jaafara i innych z 2020 roku [3]:

?Przy Ct = 35, wartość użyta do zgłoszenia dodatniego wyniku dla PCR, <3% kultur jest dodatnia?.

Innymi słowy, nie udało się wyizolować wirusa SARS-CoV-2 przy tak wysokich wartościach Ct. Co więcej, badania naukowe wykazują, że tylko wirusy niezakaźne (martwe) są wykrywane przy wartościach Ct w wysokości 35 [22].

Pomiędzy wartościami 30 a 35 mamy szarą strefę, w której nie można z całą pewnością stwierdzić, że test jest dodatni. Obszar ten powinien być wyłączony. Oczywiście można by wykonać 45 cykli PCR, zgodnie z zaleceniem zawartym w protokole WHO na podstawie Cormana i Drostena (Rysunek 4), ale wtedy należy również określić rozsądną wartość Ct? (która nie powinna przekraczać 30). Ale wynik analityczny z wartością Ct 45 jest naukowo i diagnostycznie absolutnie bez znaczenia (rozsądna wartość Ct nie powinna przekraczać 30). Wszystko to powinno być zakomunikowane bardzo jasno. Istotnym błędem jest to, że artykuł Cormana i Drostena nie podaje maksymalnej wartości Ct, przy której próbka może być jednoznacznie uznana za dodatni lub ujemny wynik badania. Ta ważna progowa liczba cykli nie jest również określona w żadnych dotychczasowych raportach uzupełniających.

Rysunek 4: Zalecenie zestawu RT-PCR w oficjalnym protokole WHO na podstawie artykułu Cormana i Drosten [8]. Jedynie wartość ?cyklowa? (cykle) została podana bez odpowiadającej jej i uzasadnionej naukowo wartości Ct (wartość odcięcia). Te lub jakiekolwiek inne wartości cykli nie są nigdzie widoczne we właściwym artykule Cormana i Drostena.

Test rozróżniający

Test RdRp:

MasterMix:    na reakcję

H2O (wolna od Rnaz)

2x mieszanka do reakcji

MgSO4(50mM)

BSA (1 mg/ml)

Starter RdRP_SARSr-F2

(10 ?M roztworu podstawowego)

Starter RdRP_SARSr-R1

(10 ?M roztworu podstawowego)

Próbnik RdRP_SARSr-P2

(10 ?M roztworu podstawowego)

Mieszkanka enzymów SSIII/Taq

Całkowita mieszanina do reakcji

Matryca RNA, dodać

Całkowita objętość

* Thermo Fischer/Invitrogen: System RT-PCR SuperScriptIII OneStep with Platinum Taq DNA Polymerase

** MgSO4 (50 mM) (Sigma). Ten komponent nie jest dostarczany z zestawem OneStep RT-PCR.

*** nieacetylowana [Roche]

1.  Walidacja biomolekularna 

Aby stwierdzić, że produkty amplifikacji metodą PCR to rzeczywiście geny SARS-CoV-2, należy dokonać ich walidacji biomolekularnej. W przypadku testu przeznaczonego do celów diagnostycznych procedura taka jest absolutnie niezbędna.

Walidacji można dokonać poprzez przepuszczenie produktów PCR przez żel agarozowy 1% z bromkiem etydyny (EtBr) wraz ze wzorcem masy cząsteczkowej (np. drabiną DNA) w celu oszacowania ich wielkości. Powinna ona opowiadać obliczonej wielkości produktu amplifikacji. Jeszcze lepszą metodę stanowi jednak sekwencjonowanie produktu PCR. Bez walidacji biomolekularnej nie można mieć pewności co do jego tożsamości. W świetle opisanych już wcześniej poważnych błędów projektowych, uzyskane produkty amplifikacji PCR mogą być w zasadzie wszystkim.

Praca Cormana-Drostena nie wspomina również o niewielkich fragmentach qPCR (ok. 100bp): w tym przypadku może to być żel agarozowy 1,5% lub wręcz akrylamidowy. Fakt, że nie przeprowadzono walidacji produktów PCR na poziomie cząsteczkowym, stanowi kolejny rażący błąd w protokole badań i sprawia, że jakiekolwiek oparte na nim testy stają się zupełnie bezużyteczne jako narzędzia diagnostyczne pozwalające stwierdzić zakażenie wirusem SARS-CoV-2.

1. Metody kontroli pozytywnej i negatywnej pozwalające potwierdzić/wykluczyć obecność wirusa

Praca Cormana-Drostena opiera się na niepotwierdzonym założeniu, że wirus SARS-CoV-2 to jedyny z beta-koronawirusów typu SARS, który w chwili obecnej powoduje zakażenia u ludzi. Sekwencje, na jakich opiera się metoda PCR zastosowana przez badaczy, to sekwencje in silico przedstawione przez chińskie laboratorium [23]; w chwili, gdy opracowywano test PCR, autorzy nie mieli bowiem dostępu do materiału kontrolnego w postaci zakaźnego (?żywego?) ani inaktywowanego wirusa SARS-CoV-2. Test PCR zaprojektowano więc w oparciu o znaną sekwencję SARS-CoV, która posłużyła za materiał kontrolny dla sekwencji Sarbeco (Adam Meijer ? współautor pracy Cormana-Drostena ? w wymianie e-mailowej z Peterem Borgerem) [2]

Przyjmuje się, że wszyscy pacjenci z dodatnim wynikiem testu RT-PCR przeprowadzonego zgodnie z protokołem opisanym w pracy Cormana-Drostena są rzeczywiście zakażeni wirusem SARS-CoV-2. W tym założeniu kryją się jednak trzy poważne błędy. Po pierwsze, dodatni wynik opisanego w pracy Cormana-Drostena testu na cząsteczki RNA nie oznacza jeszcze ?zakażenia wirusem? ?  wskazuje jedynie na obecność cząsteczek wirusowego RNA. Jak wykazano w punkcie 1d (powyżej), metoda Cormana-Drostena nie wykrywa całego wirusa, a zaledwie jego fragment. Jak już stwierdziliśmy, sprawia to, że test PCR nie nadaje się do zastosowania w diagnostyce wirusowych zakażeń SARS.

Po drugie ? i co ważniejsze ? funkcjonalności opublikowanego testu nie dowiedziono z użyciem pozytywnego materiału kontrolnego (wyizolowanego RNA wirusa SARS-CoV-2), co stanowi niezbędny złoty standard postępowania.

Po trzecie, jak czytamy w pracy Cormana-Drostena:

?Aby wykazać, że test może wykrywać również inne, pochodzące od nietoperzy wirusy pokrewne SARS, przeprowadziliśmy badanie na obecność genu E w sześciu próbkach kału nietoperzy uzyskanych od Drexler i in. (?) oraz Muth i in. (?). Zakażone wirusem próbki pochodziły od europejskich nietoperzy podkowcowatych. Skuteczne wykrycie tych filogenetycznych przypadków w składzie SARS-CoV sugeruje, że test może prawdopodobnie wykryć wszystkie wirusy azjatyckie. Oznaczałoby to teoretycznie szeroki zakres czułości nawet w przypadku licznych, niezależnych zakażeń różnymi wariantami wirusów z rezerwuaru zwierzęcego.?

Powyższe stwierdzenie jasno pokazuje, że wykorzystywany w teście RT-PCR gen E nie jest swoisty dla wirusa SARS-CoV-2.

Startery genu E pozwalają wykrywać również wiele innych wirusów SARS.

Spośród wszystkich zakaźnych dla ludzi wirusów RNA genom koronawirusa jest największy. Wszystkie te wirusy charakteryzują się bardzo podobną strukturą cząsteczkową, w SARS-CoV1 i SARS-CoV-2 można jednak wskazać dwa swoiste ?genetyczne odciski palców?, które odróżniają je od innych koronawirusów. Jest to, po pierwsze, unikalna sekwencja  (KTFPPTEPKKDKKKK) obecna w białku N wirusa SARS-CoV oraz SARS-CoV-2 [13,14,15]. Po drugie, ani SARS-CoV1, ani SARS-CoV2 nie zawierają genu kodującego białko HE, którego obecność stwierdza się u wszystkich innych koronawirusów [13, 14]. A zatem aby mieć pewność, że produktem PCR jest rzeczywiście wirus SARS-CoV-1 lub SARS-CoV-2 za cel amplifikacji należało obrać wyżej wspomniany obszar genu N. Rzetelny test diagnostyczny powinien skupiać się właśnie na tym swoistym obszarze. W pracy Cormana-Drostena test PCR dla genu N nie został poddany dalszej walidacji i nie zalecono jego stosowana, ponieważ okazał się ?niezbyt czuły? w początkowych badaniach nad SARS-CoV [1].

Co więcej, fakt, że zarówno w SARS-CoV1, jak i w SARS-CoV-2 brakuje genu HE, oznacza, że stanowi on idealny materiał do kontroli negatywnej, która pozwalałaby wykluczyć obecność innych koronawirusów. W pracy Cormana-Drostena tego faktu nie wykorzystano; nie zastosowano również żadnych innych metod kontroli negatywnej. Proponowany protokół testu PCR  nie zawiera zatem metod kontroli pozytywnej ani negatywnej, które pozwalałaby wykluczyć obecność innych koronawirusów. Jest to kolejny istotny błąd, który czyni go niezdatnym do celów diagnostycznych.

1. Nie określono standardowej procedury operacyjnej (SOP)

Należy opracować standardową procedurę operacyjną (SOP), która będzie jednoznacznie określać powyższe parametry, co pozwoli wszystkim laboratoriom stworzyć identyczne warunki testowe. Posiadanie ogólnie obowiązującej, zwalidowanej procedury SOP jest konieczne, ponieważ tylko ona umożliwia porównywanie danych uzyskanych na poziomie krajowym i międzynarodowym. Wszystkie parametry starterów bezwzględnie należy określić w sposób jednoznaczny. W pracy Cormana-Drostena tego nie uczyniono. Co więcej, nie podano wartości Ct określającej kiedy próbkę należy uznać za dodatnią, a kiedy za ujemną. Nie określono również, kiedy należy stwierdzić zakażenie wirusami SARS-CoV. Jak wspomniano wyżej, test PCR nie rozróżnia między obecnością wirusa a obecnością jego fragmentów, dlatego też tak istotne jest podanie wartości Ct wskazującej na wynik dodatni. Wartość Ct powinna określać standardowa procedura operacyjna (SOP) udostępniona online tak, by wszystkie laboratoria mogły zastosować identyczne warunki graniczne. Fakt, że taka procedura nie istnieje, stanowi poważne uchybienie podstawowym zasadom nauki. W obecnej sytuacji laboratoria w całej Europie przeprowadzają testy wedle własnego uznania, co prowadzi do ogromnego zakresu zmienności. Muszą w pierwszej kolejności zadać sobie szereg pytań: jakie startery zamówić? Jakimi nukleotydami uzupełnić chwiejne pozycje? Jaką wartość Tm wybrać? Ile cykli PCR przeprowadzić? Przy jakiej wartości Ct wynik należy uznać za dodatni? Przy jakiej za ujemny? Ile genów przetestować? Wszystkie czy tylko geny E i RpRd, jak pokazano w tabeli 2 w pracy Cormana-Drostena? Czy sprawdzić również gen N? Jakie metody kontroli pozytywnej zastosować? A jakie kontroli negatywnej?

Opisany protokół jest niestety błędnie zaprojektowany i bardzo niejasny, co sprawia, że można go interpretować na wiele różnych sposobów. Ponieważ brakuje standaryzacji i procedury SOP, nie do końca wiadomo jak należy ten test stosować.

1. Konsekwencje błędów opisanych w punktach 1-5: fałszywe wyniki dodatnie

Projekt opisanego w pracy Cormana-Drostena testu RT-PCR zawiera tyle błędów na poziomie biologicznym i molekularnym (patrz 1-5), że nie pozwala na uzyskanie jednoznacznych wyników. W sposób nieunikniony prowadzi to do olbrzymiej liczby wyników ?fałszywie dodatnich?. Przez wynik fałszywie dodatni należy rozumieć sytuację, w której próbka ujemna początkowo daje wynik dodatni, a po powtórzeniu tego samego testu okazuje się ujemna. Fałszywe wyniki dodatnie to błędne wyniki dodatnie, tj. próbki, które dają wynik dodatni, mimo że są ujemne. Tak właśnie dzieje się w przypadku metody Cormana-Drostena. Na stronie 6 manuskryptu PDF autorzy pokazują, że nawet w dobrze kontrolowanych warunkach laboratoryjnych stwierdza się znaczący odsetek wyników fałszywie dodatnich:

?W czterech reakcjach testowych zaobserwowano początkowo słabą reaktywność, ale po ponownym przetestowaniu próbki za pomocą tego samego testu uzyskano ostatecznie wynik ujemny. Sygnały te nie wiązały się z żadnym konkretnym wirusem, a dla każdego wirusa, w przypadku którego początkowo wystąpiła reaktywność dodatnia, istniały próbki, które wyniku dodatniego nie dały, mimo że zawierały tego samego wirusa w stężeniu jeszcze wyższym. Biorąc pod uwagę wyniki opisanej wyżej kwalifikacji technicznej, stwierdzono, że początkowa reaktywność nie była skutkiem chemicznej niestabilności testu RT-PCR, a prawdopodobnie rezultatem problemów z obsługą spowodowanych nagłym wprowadzeniem nowych testów diagnostycznych i kontrolnych w trakcie omawianego badania? [1]

Już pierwsze zdanie powyższego fragmentu jasno stwierdza, że opisany w pracy Cormana-Dorstena test prowadzi do wyników fałszywie dodatnich. Nawet w dobrze kontrolowanych warunkach nowoczesnego laboratorium Charité spośród 310 testów aż cztery dają początkowo wynik fałszywie dodatni. Cztery próbki ujemne dają wynik dodatni, a po powtórzeniu ? ujemny. To klasyczna definicja wyniku fałszywie dodatniego. Autorzy pracy nie stosują jednak tego określenia, co stanowi jawny przykład intelektualnej nieuczciwości.

W powyższym fragmencie można również zauważyć, że autorzy starają się te fałszywe wyniki dodatnie zbagatelizować, wyjaśniając, że wynikają one z ?problemów z obsługą spowodowanych nagłym wprowadzeniem nowych testów diagnostycznych?. Proszę sobie tylko wyobrazić sytuację laboratoriów, które muszą stosować test PCR bez niezbędnych informacji, które zawiera zazwyczaj procedura SOP.

1. Praca Cormana-Drostena nie przeszła procesu recenzji naukowej

Przed formalną publikacją w czasopiśmie naukowym prace naukowe i medyczne przechodzą zazwyczaj proces recenzji naukowej. Redakcja czasopisma może zasięgnąć opinii ekspertów (?recenzentów?), których zadaniem będzie ogólna ocena pracy i określenie ewentualnych słabych punktów w jej założeniach, metodologii i wnioskach. Czasopismo decyduje się opublikować artykuł zazwyczaj dopiero wówczas, gdy stwierdzi, że jego autorzy udzielili zadowalającej odpowiedzi na zastrzeżenia recenzentów, a przedstawione dane rzeczywiście potwierdzają wyciągnięte w pracy wnioski. Proces ten obowiązuje również w Eurosurveillance [16].

Pracę Cormana-Drostena zgłoszono do publikacji w Eurosurveillance 21 stycznia 2020 roku; dzień później została ona ostatecznie przyjęta, a 23 stycznia 2020 r. była już dostępna online. Wersję 1-0 protokołu opublikowano na oficjalnej stronie internetowej Światowej Organizacji Zdrowia 13 stycznia 2020 r. [17]; 17 stycznia zaktualizowano ją do wersji 2-1 [18] ? stało się to jeszcze zanim 23 stycznia pracę Cormana-Drostena opublikowało Eurosurveillance.

Recenzja naukowa stanowi z reguły proces czasochłonny, obejmuje bowiem krytyczną lekturę i komentarz przynajmniej dwojga ekspertów z danej dziedziny. Naszym zdaniem omawiana praca takiej procedury nie przeszła. Dwadzieścia cztery godziny to na przeprowadzenie skrupulatnej recenzji naukowej po prostu za mało. Do podobnego wniosku zdają się również prowadzić liczne, bardzo poważne błędy projektowe, które czynią test PCR niezdatnym do wykorzystania w diagnostyce zakażeń wirusem SARS-CoV-2.

Każdy biolog molekularny, któremu nieobce jest badanie RT-PCR, byłby w stanie w pracy Cormana-Drostena dostrzec poważne uchybienia jeszcze przed faktycznym procesem recenzji naukowej. 26 października 2020 r. poprosiliśmy Eurosurveillance o przesłanie nam kopii raportu z recenzji naukowej pracy. Dokumentu nie otrzymaliśmy do dzisiaj, a w liście datowanym na 18 listopada 2020 r., Europejskie Centrum ds. Zapobiegania i Kontroli Chorób (ECDC), wydawca Eurosurveillance, odmawia nam dostępu do wyników recenzji, nie podając jednocześnie istotnych z naukowego punktu widzenia  przyczyn tej decyzji. Stwierdza po prostu, że ich ?ujawnienie podważyłoby cele badań naukowych?. [24].

1. Autorzy jako wydawcy

Na koniec należy poruszyć jeszcze jeden istotny problem. Okazuje się, że dwoje spośród autorów pracy Cormana-Drostena ? Christian Drosten i Chantal Reusken ? zasiada również w redakcji czasopisma, w którym się ona ukazała [19]. Wynika stąd poważny konflikt interesów, co dodatkowo wzmaga podejrzenie, że pracy nie poddano zwyczajowemu procesowi recenzji naukowej. Wygląda na to, że szybka publikacja była możliwa wyłącznie dlatego, że autorzy artykułu to jednocześnie członkowie redakcji Eurosurveillance. Należy stwierdzić, że praktyka taka stanowi jawne naruszenie zasad etyki naukowej.

WYKAZ BŁĘDÓW ? PODSUMOWANIE

Praca Cormana-Drostena zawiera następujące błędy:

1. Nie wyjaśniono dlaczego w podanym protokole wykorzystuje się tak ekstremalnie wysokie stężenia starterów. Opisane stężenia prowadzą do zwiększenia liczby wiązań nieswoistych i amplifikacji produktów PCR, co sprawia, że test nie nadaje się do zastosowania w diagnostyce zakażeń wirusem SARS-CoV-2.

2. Sześć pozycji chwiejnych wprowadza olbrzymią zmienność w laboratoryjnych zastosowaniach testu; niejasny opis protokołu w pracy Cormana-Drostena nie określa standardowej procedury operacyjnej, co sprawia, że test nie nadaje się do zastosowania w diagnostyce zakażeń wirusem SARS-CoV-2.

3. Test PCR nie rozróżnia między obecnością całego wirusa a obecnością jego fragmentów. Dlatego też nie nadaje się do diagnostyki całych (zakaźnych) wirusów, a przeto nie może służyć do wykrywania wirusa SARS-CoV-2 i wnioskowania o obecności zakażenia.

4. Różnica 10° C względem temperatury wyżarzania Tm dla pary1 (RdRp_SARSr_F oraz RdRp_SARSr_R) również sprawia, że test nie nadaje się do zastosowania w diagnostyce zakażeń wirusem SARS-CoV-2.

5. Poważny błąd stanowi pominięcie wartości Ct, przy której próbkę należy uznać za dodatnią lub ujemną. Wartości Ct nie dodano również później, co sprawia, że test nie nadaje się do zastosowania w diagnostyce zakażeń wirusem SARS-CoV-2.

6. Produkty PCR nie zostały poddane walidacji na poziomie molekularnym. Oznacza to, że test nie nadaje się do zastosowania w diagnostyce zakażeń wirusem SARS-CoV-2.

7. Dla testu PCR nie istnieją metody kontroli pozytywnej, pozwalające ocenić jego swoistość dla wirusa SARS-CoV-2, ani metody kontroli negatywnej, pozwalające wykluczyć obecność innych koronawirusów, co sprawia, że test nie nadaje się do zastosowania w diagnostyce zakażeń wirusem SARS-CoV-2.

8. Konstrukcja testu opisana w pracy Cormana-Drostena jest tak niejasna i wadliwa, że można ją interpretować na wiele sposobów; brakuje standaryzacji i procedury SOP, co stawia pod znakiem zapytania ważność testu i sprawia, że nie nadaje się on do zastosowania w diagnostyce zakażeń wirusem SARS-CoV-2.

9. Praca Cormana-Drostena nie przeszła prawdopodobnie przed publikacją procesu recenzji naukowej, co sprawia, że test nie nadaje się do zastosowania w diagnostyce zakażeń wirusem SARS-CoV-2.

10. Poza tym, że dwoje spośród autorów pracy Cormana-Drostena (Christian Drosten  i Chantal Reusken) zasiada w redakcji Eurosurveillance, stwierdziliśmy również występowanie poważnego konfliktu interesów w przypadku co najmniej czterech autorów. 29 lipca 2020 r. podano do wiadomości występowanie konfliktu interesów, którego nie zadeklarowano w pierwotnej wersji pracy (i którego wciąż nie podaje wersja PubMed) ? Olfert Landt pełni funkcję CEO w firmie TIB-Molbiol, a Marco Kaiser to nie tylko starszy pracownik naukowy w GenExpress, ale i konsultant naukowy w TIB-Molbiol. TIB-Molbiol to z kolei firma, która ?jako pierwsza? wyprodukowała zestawy PCR (Light Mix) w oparciu o protokół opublikowany w manuskrypcie Cormana-Drostena; jak sama przyznaje, zestawy trafiły do dystrybucji zanim jeszcze tekst zgłoszono do publikacji [20]. Co więcej, Victor Corman i Christian Drosten nie zadeklarowali swojej afiliacji z  przeprowadzającym testy komercyjnym laboratorium ?Labor Berlin?. Obaj odpowiadają w nim za diagnostykę [21], a firma działa w obszarze testów PCR.

W świetle przeprowadzonego przez nas ponownego badania protokołu wykrywania obecności SARS-CoV-2 opisanego w pracy Cormana-Drostena stwierdzamy niepokojące błędy i uchybienia, które sprawiają, że test PCR na SARS-CoV-2 jest bezużyteczny.

WNIOSKI

Decyzja o publikacji i szerokim udostępnianiu protokołów testowych należy do Eurosurveillance. Przyznanie, że w pracy Cormana-Drostena występują poważne uchybienia, pozwoli znacząco ograniczyć koszty ludzkie i oszczędzić pacjentom zbędnych cierpień. 

Czy wycofanie tej pracy nie leży w interesie Eurosurveillance? Nasz wniosek jest jednoznaczny: w świetle kolosalnych błędów w protokole PCR, które opisano w niniejszej petycji, zasady etyki i odpowiedzialności naukowej nie pozostawiają właściwie innego wyboru.